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正常人肾上腺组织基因表达谱的研究 |
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RH-ACTH-cortisol regulatory network in AD.
Key words：Adrenal glands; Gene expression; Expressed sequence tags; Computational biology▲
肾上腺在维持内环境稳定、应激、机体防御及免疫调控中发挥重要作用，且在糖、脂肪、水及电解质代谢中亦有重要作用。表达序列标记(expressed sequence tags, ESTs)是通过对cDNA 文库测序 所阅读的序列片段，因其是基因全长的一部分，故可作为基因的表达标志。通过ESTs测序，可建立特定组织或细胞的基因表达谱目录，对深入理解其基因调控及生理功能具有重要意义，亦是对人类基因组计划的贡献〔1〕。目前，已有用ESTs对一些组织细胞，如心脏〔2〕、骨胳肌〔3〕及CD+造血干细胞〔4〕作了基因表达研究。在公共数据库中仅有少量ESTs来自正常肾上腺组织，不足以描绘出基因表达谱。因而，本研究是用ESTs方法，建立正常肾上腺组织的基因表达目录，为肾上腺的生理功能及病理生理过程研究打下基础。
材料和方法
一、组织来源
肾上腺组织来源于征得家属书面同意的意外死亡的正常男性，年龄25岁，死亡后4小时内获取组织，立即置液氮中贮存备用。
二、RNA的抽提及cDNA文库的构建
采用TRIzol reagent (GIBCO/BRL)试剂抽提总RNA。再用mRNA oligoTex mini kit (Qiagen, Germay)分离mRNA。cDNA文库采用λZAPⅡ文库构建试剂盒(Stratagene, La Jolla, California)，定向克隆构建cDNA文库。少量序列来自SMART PCR cNDA文库，该文库采用SMART PCR cDNA文库构建试剂盒(Clontech)。
三、DNA模板的制备及自动测序
从LB平板(氨苄青霉素/IPTG)上随机挑选阳性克隆，用R.E.A.L Prep96 Plasmid Kit (Qiagen, Chatsworth, CA)抽提双链DNA模板。测序反应用标记双脱氧核糖核酸(Dye-terminator)的循环测序试剂盒(Perkin-Elmer)，在9700 PCR仪(Perkin-Elmer)上进行荧光引物引导下的延伸反应。用377 DNA自动测序仪(Perkin-Elmer)进行自动测序。
四、数据收集和分析
用Data Collection,Sequencing Analysis (Perkin-Elmer)软件收集原始数据，并用Factura 3.0软件(Perkin-Elmer)去除载体序列。序列中不确定碱基(N)的百分比≤3%及长度大于100bp者为可分析序列。用Fetch 3.0软件将所有数据传递到工作站(Sun)，序列分析采用GCG软件包(Genetic Computer Group, Version 9.0)，首先经Cross-match软件(WashU)去除线粒体DNA及Alu等重复序列及残留的载体序列，用Blast、Fasta软件将可分析序列与公共数据库GenBank和dbESTBank作比较。若与人类某一基因同源性95%以上、重叠长度大于100bp者即代表该基因，归入已知基因。
五、基因功能分类
根据其功能将已知基因分为8类〔4，5〕：C1：内分泌相关；C2：细胞分裂；C3：信号转导/细胞通讯；C4：细胞结构/运动；C5：机体/细胞防御；C6：基因/蛋白表达；C7：代谢；C8：不能分类。基因表达丰度用文库中与该基因匹配的ESTs拷贝数表示。
结果
一、基因分类及表达
肾上腺文库中有效序列为9875条，其中已知基因为3876条，占39.2%，同类整合后为1532个基因品种。基因分类显示C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7及C8类分别为11%、14%、10%、6%、10%、21%、17%和11%。对C1类基因进一步分类显示激素或分泌蛋白为10条、受体为21条、与受体有关的信号分子为75条、激素合成、分泌及转运有关基因为53条、不能归类者4条。若将C1类的信号分子及与信号转导有关的基因同C3类合并后，所有与信号转导及细胞间通讯有关基因占16%。
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