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抗氧化维生素减轻高脂饮食兔动脉粥样硬化及保护DNA甲基化的作用 |
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药厂)，β-胡萝卜素(瑞士罗氏药品化学有限公司)，高效液相色谱仪(HPLC)：Backman黄金系统通用Ⅰ型，166检测器，126泵。层析柱：ODS柱，250×4.6 mm。
二、实验方法
兔随机分成高脂饮食组5只，除正常饮食外，1.5 g胆固醇，每日给2.5 g猪油/只；高脂抗氧化维生素组5只，维生素E 100mg，维生素C 200 mg，每日给β-胡罗卜素5mg/只，其余同高脂饮食组。喂养3个月后处死动物。
1.病理：各组兔以外力处死，在距主动脉瓣根部5 mm处定点取材，石蜡切片，HE染色光学显微镜观察。
2.兔脾脏细胞核DNA抽提及DNA甲基化水平测定方法仿照文献［3］：每组5只兔，每只兔脾脏定位取材，称0.5 g，用生理盐水冲洗，放入含0.5 ml预冷的RSB(0.01 mol/L pH 7.4, 0.01 mol/L NaCl, 0.025 mol/L EDTA pH 8.0)缓冲液的玻璃管中，在冷酒精浴中电动匀浆至组织块消失。转移至1.5 ml的Eppendof管中，加10%SDS 70μl，65℃水浴30分钟后，加蛋白酶K到终浓度100 μg/ml，55℃滚动消化至有形成分消失。加入等体积酚振摇，12000 rpm/min离心15分钟，取上层水相，再酚抽提1次，25∶24∶1的酚、氯仿、异戊醇抽提2次，加RNA酶终浓度到100 μg/ml，37℃保温1小时用等体积酚及等体积25∶24∶1的酚、氯仿、异戊醇各抽提1次。取上清液，加2体积无水酒精，1/10体积醋酸钠(0.3 mol,pH 8.0)，沉淀DNA，12000rpm/min，离心10分钟，无水酒精洗一次，溶于TE液。于260nm和280nm测定吸光度，计算DNA的含量，算出A260/A280的比值。其比值在1.7左右。1%琼脂糖凝胶电泳2小时，紫外线灯下观察，分子较大。将DNA用2倍的冷乙醇沉淀后，真空抽干，用氰氟酸(100μl/1mg DNA)于80℃水解80分钟，真空抽干，重新溶于洗脱剂中(0.02mol/L的磷酸二氢铵缓冲液，pH 2.3)，然后于HPLC上测定碱基含量。洗脱液流速是2.5ml/min，检测器波长为280nm。上样量20μl。
结果
一、光学显微镜观察
高脂饮食组主动脉内膜脂质斑块弥漫增厚，平均泡沫细胞10～12层，部分斑块中平滑肌细胞增生明显。高脂抗氧化维生素组主动脉内膜脂质斑块明显减轻，平均泡沫细胞5层左右，平滑肌细胞明显减少(图1～3)［4］。
二、甲基化水平测定
图1 正常饮食组：兔主动脉内膜无明显病变
图2 高脂饮食组：兔主动脉内膜脂质斑块明显增厚，斑块内有增生的平滑肌细胞和大量的泡沫细胞 图3 高脂抗氧化维生素组：兔主动脉内膜脂质斑块增厚，斑块内有较多的泡沫细胞
各组细胞核DNA水解后，用HPLC分析所得层析图谱表明，无尿嘧啶存在，也即本实验所测碱基成分仅为DNA的水解产物，完全排除了RNA的干扰。甲基化水平按以下公式计算。(DNA甲基化程度用甲基化的脱氧胞嘧啶占全部脱氧胞嘧啶的百分数表示)
甲基化水平=(5-甲基胞嘧啶(5-mC)峰积面积)/(5-mC峰积面积+胞嘧啶(C)峰积面积)×100
各峰积面积的数值由高效液相色谱仪自动打印出，各组数值见附表。
讨论
我们利用光学显微镜观察及用HPLC进行碱基分离、测定。结果表明，抗氧化维生素制剂能减轻高脂饮食引起的主动脉平滑肌细胞增生及动脉粥样硬化(AS)的程度，并有提高高脂饮食兔甲基化水平的作用。现认为，AS是一种伴随血管内皮细胞和平滑肌细胞增生病变的疾病。有实验表明，基因不正常表达可能是心血管病细胞增生的原因之一。有文献报道［5］，N-ras癌基因表达增加，伴随平滑肌细胞增生；在AS斑块部位的平滑肌细胞分别检测到血管
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