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Balb C乳鼠实验性感染汉坦病毒与脑神经细胞凋亡 |
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嗜酸样坏死，且病变存在于皮质层、海马和基底核，但这些病变中是否有细胞凋亡，作者目前尚未见报道。现就这一问题进行研究。
材料和方法
一、材料
(一) 抗体 抗HV糖蛋白2(G2)单克隆抗体(MAb)LV48A(中国预防科学院病毒研究所)；抗HV核蛋白MAb1A8，抗HV血凝素(HA)MAb3D8，8G3(第四军医大学分子病毒研究所)。
(二) 动物来源 2～3 d龄Balb/C乳鼠，雄雌不分，由第四军医大学实验动物中心提供。
(三) 主要试剂 非放射性标记试剂盒及检测试剂盒Dig-11-dUTP(Boehringer Mannheim德国)，PAP试剂盒和BSA(Fraction V.Sigma华美生物工程公司)，质粒M56含有Hantaan病毒M全cDNA系Schmalijohn构建，HV陈株F1M10(第四军医大学分子病毒室薛小平博士提供)。蛋白酶K(Boehringer Mannheim德国)，DNA聚合酶Ⅰ(Promega Ihadisob WⅠ)，RNase DNase(购于华美生物制品公司)，Taq酶(Boehringer Mannheim德国)，RNase,AMV酶(购于华美生物制品公司)。
二、方法
(一) 病毒接种 以100LD50HV，0.05 ml经腹腔途径感染病毒Balb/C乳鼠。
(二) 标本制备 乳鼠接种后分别于第1、2、4、6、8、10、12及14 d，解剖取鼠脑，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，制成5 μm切片。
(三) 免疫组织化学 一抗为1∶2 000稀释的LV48A，1A8，3D8，8G3，4℃温育36 h，然后按文献［2，3］介绍的多重PAP法染色检测病毒抗原。实验同时设有阳性对照，正常组织阴性对照。
(四) 原位分子杂交 质粒M56经内切酶PstⅠ消化，分离回收特异性片段后，用Dig-11-dUTP随机引物延伸法标记做为探针。分子杂交过程分别按有关文献［4，5］及试剂盒操作指南进行。同时设不含探针的空白对照和RNase消化组织阴性对照。
(五) 原位末端标记［6，7］ 石蜡切片常规脱蜡，蛋白酶K消化后脱水干燥，加标记反应液(50 mmol/L Tris-HCl,5 mmol/L MgCl2,10 mmol/L DTT,0.05% BSA,0.01 mmol/L dATP,dCTA,dGTP,0.006 5 mmol/L dTTP,0.003 5 mmol/L digoxigenin-11-dUTP;Klnow酶20U)37℃，2 h，其余检测步骤按试剂盒操作指南进行。实验同时设有正常阴性对照。
结果
一、脑组织中HV抗原定位
所有感染标本除第1 d外，均在大脑皮质海马、基底核的神经细胞中查到了病毒抗原。在脑组织中抗原主要分布于神经细胞胞浆内，呈棕黄色颗粒(图1)，正常、替代及空白对照呈阴性。阳性对照结果稳定。
二、脑组织病毒RNA的定位分布
所有感染标本中，均能检到HV RNA，RNA分布于皮质、海马、基底核和白质中的神经细胞中，阳性颗粒或阳性反应主要位于核周，沿核膜密集排列(图2)。
三、脑组织中的凋亡细胞
所有标本中均有凋亡细胞，阳性呈蓝色颗粒，位于神经细胞核内，分布于皮质、海马及白质中(图3)，以皮质和海马部位较多。
四、脑组织中凋亡细胞的分布与HV抗原、HV RNA定位的关系
HV抗原和HV RNA主要分布在大脑皮层、海马的神经细胞中，凋亡细胞在此部位多见。
讨论
已证实HV在许多实验动物体内呈泛嗜性感染，乳鼠脑对HV高度易感。HV可以穿过血脑屏障造成中枢系统感染，特别是早期出现的神经精神症状，包括躁动、抽搐等，这除与脑水肿、脑出血及尿毒症等有关外，病毒作用是不可忽视的原因之一。Yoneda等［8］报道病毒感染可造成细胞凋亡。
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