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G CSF体外诱导新生小鼠心肌干细胞分化的研究 |
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分为梭形，培养过程中大部分小圆细胞保持其小而圆的形态，但仍有小部分伸展为梭形。各诱导组的细胞亦可见类似上述的现象。
2.2 共聚焦显微镜下免疫荧光细胞图像 免疫荧光染色证实，部分原代细胞的表面表达Sca1和CD 45标记。（图2A、C为细胞图像，可见为小而圆细胞与梭形细胞混合生长；图2B中部分细胞表面带有Sca1标记的绿色荧光；图2D中亦可见部分细胞表面带有CD 45标记的红色荧光。）而纯化的细胞高度表达Sca1，几乎不表达CD 45。（图2E、G为细胞图像；图2F中几乎所有纯化的细胞表面都带有Sca1标记的绿色荧光；图2H中只有极个别的细胞表面带有CD 45标记的红色荧光。）
2.3 半定量RTPCR电泳图 半定量RTPCR检测诱导前后细胞心肌转录因子GATA4及心肌结构基因βMHC的表达。图3 A与B分别为诱导前、后两基因在细胞中表达的电泳图。（Marker：100～1 500 bp；内参βActing：583 bp；GATA4：275 bp；βMHC：205 bp）
结果显示，纯化后未经诱导的细胞表达GATA4，但不表达βMHC，表明纯化后的细胞极可能为CSCs；经诱导后的细胞仍然不表达βMHC，表明诱导后的细胞并非心肌细胞。
2.4 流式细胞术结果分析图 检测原代细胞Sca1与CD 45的表达情况及纯化后细胞的纯度。对比研究细胞表面标志物Sca1在空白对照组及各诱导组中的差异。图4A、B分别为原代细胞在流式细胞仪中Sca1与CD 45的表达图；图4C为原代Sca1+/ CD 45－细胞的流式图；图4D、E分别为纯化细胞在流式细胞仪中Sca1与CD 45的表达图；图4F、G、H、I、J分别为观察终点空白对照组、诱导1～4组细胞在流式细胞仪中Sca1的表达图。
流式检测结果显示，原代细胞约40％表达Sca1，约30％表达CD 45，而Sca1+/ CD 45－细胞只有约27％。经MACS纯化之后，细胞高度表达Sca1，基本上不表达CD 45，Sca1+/ CD 45－的纯度可达95％。观察终点的细胞Sca1的表达比诱导前（即纯化细胞）明显下降，但将空白对照组与各诱导组细胞表达Sca1的情况进行对比，发现Sca1在各组中的表达并无显著性差异（对比分析结果见表1）。 表1 流式细胞术结果统计分析表 注：*与诱导1～4组比较P＞0.05
3 讨 论
3.1 心肌干细胞的表型选取 学者对心肌干细胞（CSCs）的研究表型的选择上不甚一致。本实验选用目前报道较多的Sca1作为标志物，并辅以CD 45进行亚群分类。Sca1是一种干细胞表面抗原，分子量为18 ku磷脂酰肌醇锚定蛋白，Ly6抗原家族的一员，在造血干细胞、上皮前体细胞及多种组织均有表达。近年发在现人类、狗及鼠类的心脏也有Sca1的表达。CD 45是白细胞共同抗原，表达量在成熟淋巴细胞最高，单核细胞、粒细胞、早期造血细胞依次减弱。我课题组已从新生小鼠心肌组织中成功培养及初步分离得到CSCs，流式细胞术检测见原代与传代细胞基本不表达CD 34、CD 8两个标记，排除了该类细胞是造血干细胞、成熟内皮细胞的可能性[9]。我们采用组织块贴壁法培养出的原代细胞经流式鉴定及免疫荧光染色检测后证实其部分表达Sca1与CD 45，应用免疫磁珠细胞分离技术成功得到高纯度的Sca1+/CD 45－细胞，经RTPCR检测后发现其表达心脏转录因子GATA4但不表达心肌结构基因βMHC，实验结果与Hid上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] 下一页
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