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G CSF体外诱导新生小鼠心肌干细胞分化的研究 |
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收缩变圆，立即加入少量CEM培养液终止反应。反复用滴管吸取瓶底液体轻轻吹打培养瓶壁，使贴壁细胞脱落形成细胞悬液。将悬液予200目细胞筛过滤到离心管中，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入少量DPBS重悬细胞得到单细胞悬液。所得的细胞悬液在进行细胞标记后采用德国Miltenyi Biotec公司的免疫磁珠细胞分离产品进行富集纯化，分离步骤严格按照产品说明书的指示进行。分离采用两次阳性分选法，首先标记CD 45，去除CD 45+细胞后再予Sca1标记CD 45－的细胞，最后收集到的细胞为Sca1+/ CD 45－细胞。收集到的细胞分组培养，空白对照组用CGM培养液（成份：35% IMDM，65% DMEM F12，2% B27，10 ng/ml EGF，20 ng/ml bFGF，40 nmol/L Cardiotrophin1，40 nmol/L thrombin，100 u/ml青霉素G，100 μg/ml链霉素，2 mmol/L L谷氨酰胺，0.1 mmol/L 2巯基乙醇）培养，诱导组则分别用0.4 ng/ml、0.8 ng/ml、1.6 ng/ml及3.2 ng/ml 4个浓度的GCSF诱导72 h后继续予CGM培养作为诱导1～4组，予每2～3 d换液1次，并每天于倒置显微镜下观察细胞生长情况。所有细胞的观察终点相同，为诱导后培养3周。
1.3 免疫荧光染色检测细胞 细胞原代
培养约3周细胞可长满瓶底，可采用前述方法制成细胞悬液，将细胞悬液移入预先铺有盖玻片（浸泡过多聚赖氨酸）的培养皿中并放回培养箱中进行细胞爬片，24 h后于倒置显微镜下可观察到细胞完全贴壁。弃去培养液，予DPBS振荡洗涤3次，4％多聚甲醛室温下固定15 min，DPBS振荡洗涤3次，滴加经稀释至染色效价为1∶200或1∶250的荧光抗体FITC antimouse Sca1、PE antimouse CD 45，在4℃避光染色过夜，DPBS振荡洗涤5次，弃去洗涤液取出盖玻片予水性封片剂封片，共聚焦显微镜下观察细胞。另外，纯化的细胞亦以上述方法进行细胞爬片及免疫荧光染色。
1.4 流式细胞术检测细胞 原代细胞增殖至铺满瓶底时，可采用前述方法制成细胞悬液，取细胞悬液，台盼蓝染色后于细胞计数板上计数活细胞数，调整细胞浓度至106个/ml，送流式鉴定。另外，取纯化后诱导培养3周的各组细胞及空白对照组细胞同样配制成浓度为106个/ml细胞悬液，送流式鉴定。检测的细胞表面标志物为Sca1和CD 45。
1.5 半定量RTPCR检测 取纯化后未诱导及经诱导后培养3周的细胞行半定量RTPCR检测，检测的表达物有GATA4及βMHC。
1.6 统计学处理 将诱导后培养3周的细胞经流式细胞仪检测，比较空白对照组细胞与各诱导组细胞表面标记物Sca1表达的差异。所得到的数据以均数±标准差（x±s）表示。应用SPSS 13.0统计软件包进行χ2检验分析，以P＜0.05为差异具有显著性。
2 结 果
2.1 细胞生长情况 心肌组织块接种到培养中24 h后于倒置显微镜下可观察到有少量成纤维细胞样细胞从组织块中爬出，48～72 h后开始有小圆的透亮细胞爬出。原代细胞一般3周左右可以长满瓶底，培养过程中可见部分小圆细胞伸展变成梭形，呈现小圆细胞与梭形细胞混合生长。纯化的细胞绝大部分为小圆形，小部上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] 下一页
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