【摘要】 目的 分离并鉴定人成骨肉瘤细胞系MG63中的骨肉瘤类肿瘤干细胞。方法 通过无血清培养基加入低浓度长春新碱的方法悬浮培养成骨肉瘤细胞球来进行分离和类干细胞富集。后行细胞形态学观察、细胞球免疫荧光染色、RTPCR、流式细胞仪鉴定细胞表面标志物，成骨、成脂肪诱导及裸鼠成瘤的一系列鉴定试验。结果 悬浮培养得到肉瘤细胞球，可持续传代细胞亚系“MG63M”，多能干细胞、胚胎干细胞标志物及多药耐药基因表达均为阳性。具有很强的自我更新及多项分化能力。结论 MG63细胞系中存在具有自我更新及多向分化能力的骨肉瘤干细胞，而采用神经干细胞培养基中添加低浓度长春新碱是从骨肉瘤细胞系中分离培养出骨肉瘤干细胞的有效办法。
【关键词】 MG63细胞;单克隆;细胞株
肿瘤干细胞理论认为肿瘤中存在一小部分细胞，像正常干细胞一样，具有自我更新能力。这种为数不多的细胞呈不对称分裂，产生的绝大多数细胞是普通肿瘤细胞，而真正致瘤和维持肿瘤持续增长的类干细胞的数量是非常稀少的。根据此理论，推断骨肉瘤干细胞的存在也许正是骨肉瘤的异质性和对化疗药物的抗药性存在的关键。而Gibbs〔1〕等已经利用神经干细胞培养液悬浮成球的方法成功的分离出 骨肉瘤干细胞，也证明其表达胚胎干细胞的关键标志物，具有自我更新和多项分化能力。本研究利用肿瘤干细胞具有化疗药物抵抗的特点，使用神经干细胞培养基加入低浓度长春新碱悬浮成球的方法，进一步富集骨肉瘤肿瘤干细胞。而得到的细胞亚群同样具有自我更新和多项分化能力、更高的致瘤能力和极为显著的化疗药物耐药性。
1 材料与方法
1.1 试剂 人成骨肉瘤细胞MG63购自ATCC。高糖DMEM (Gibco，USA)，优等胎牛血清(Hyclone，USA) ，胰酶 (Promega，USA)，二甲基亚砜(DMSO，天佳生物科技有限公司中国)，Trizol、TaKaRa RTPCR Kit(TaKaRa，Japan)，CCK8(碧云天生物 研究所) ，TritonX100、PI、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、 噻唑蓝 (MTT)和表皮生长因子(EGF)(Sigma，USA)，鼠抗人CD44FITC、CD45FITC、CD106FITC、CD133FITC、CD105FITC(武汉博士德公司)，流式细胞仪(Becton Dickinson公司),PCR引物(上海生物工程公司)。
1.2 方法
1.2.1 悬浮成球试验 MG63细胞以6×104的密度接种在6孔板(Corning，Inc.，Corning,NY)，使用含有1%甲基纤维素的无血清HDMEM培养基，其中加入黄体酮(20 nmol/L)、转铁蛋白(25 mg/ml)、长春新碱(10 ng/ml)、胰岛素(20 mg/ml)，hEGF(10 ng/ml)，bFGF(10 ng/ml)每2 d加入1次，培养6 d和12 d，使用相差显微镜进行观察计数。培养5～7 d,待培养基中悬浮的肉瘤细胞球体积较大后，吸取培养基并离心，用无血清培养基重新吹打成单细胞悬液，按 1∶2或 1∶3比例传代。使用重复3次。
1.2.2 RTPCR检测类肿瘤干细胞中OCT4、Nanog、nestin、mdr1 mRNA的表达 选取生长状态良好的MG63和MG63M细胞各2×1010个细胞 /ml,按 Trizol提取试剂盒说明提取细胞内RNA。PCR扩增产物行 1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(EB)染色观察，电泳产物用FT500凝胶成像系统照相，各系统经吸光度扫描仪进行分析。
1.2.3 流式细胞仪测定细胞表面标志物 收集对数生长期的各组细胞5×105，1 000 r/min离心5 min。磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次。4%多聚甲醛固定30 min。PBS清洗1次。0.1% Triton X100 0.5 ml，10 min。PBS清洗1次。一抗(兔抗人MMP26多克隆抗体1∶1 000稀释)4℃孵育40 min，PBS清洗1次。二抗(羊抗兔FITC标记)4℃孵育40 min。PBS清洗1次，500 μl PBS重悬，流式细胞仪检测。
1.2.4 CCK8法检测类肿瘤干细胞增殖活性 生长曲线测定:细胞接种，胰酶消化80%融合状态的细胞，细胞计数以1×104接种7块96孔板，每种细胞设8个平行孔。每日定时随机取出一块孔板，每加入含10%胎牛血清的HDMEM 90 μl/孔，并加入10 ul/孔CCK8，37℃孵育3 h后测量光吸收值。统计数据、分析结果并作图。全自
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