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G CSF体外诱导新生小鼠心肌干细胞分化的研究 |
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diac Stem Cells； GCSF； Myocardial Regeneration
2003年，Beltrami AP等[1]首次证实CSCs的存在。这种细胞具有自我更新、形成克隆和多能性的特征，并能分化为心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞。将这些细胞注入缺血心脏后，这些细胞或其子代细胞能重建具有新生血管及肌细胞分化良好的心肌。随后有学者的研究发现CSCs能够穿越血管屏障再生梗死的心肌，改善心功能[2]。因此，CSCs理论上是一种有效的心肌修复工具，但实际上在心肌损伤或梗死后心脏的自我修复能力却相当有限，这提示了CSCs的心肌修复作用受到某种机制的限制。另外，由于CSCs在心脏中的数量稀少，而且在心脏中的增殖速率及激活途径都不十分明晰，因此在缺少一个或多个有效刺激因子的情况下CSCs有可能维持其干细胞的形态及稳定的细胞数量。自CSCs被发现，先后有学者用5AZA、催产素[3]、高迁移率组box 1 蛋白（highmobility group box 1 protein，HMGB1）[4]和FGF（fibroblast growth factor）[5]等刺激因素作用于CSCs希望能促进其增殖或分化成为心肌细胞，当中不乏有成功的研究。GCSF作为一种干细胞动员剂广泛地应用于科研和临床，其不但能动员骨髓来源的干细胞[6]和外周血干细胞[7]归巢到心脏参与心肌修复，而且在猪的缺血再灌注模型中其还能促进心肌血管生成及减少纤维化[8]。因此，本实验遂选用GCSF作为诱导剂，以探讨GCSF除上述效应外是否还具有将CSCs诱导成为心肌细胞的作用，进一步明晰GCSF心肌修复的作用机理。
1 材料与方法
1.1 实验动物与主要试剂 采用购自中山医科大学实验动物中心的1～2 d的SPF级新生昆明小鼠用于实验。FITC antimouse Sca1，PE antimouse CD 45，Functional Grade Purified antimouse Sca1，FITC Rat IgG 2a isotype control，PE Rat IgG 2b isotype control（ebioscience公司），Purified antimouse CD 45（BioLegend公司），免疫磁珠分离产品购自Miltenyi Biotec 公司。
1.2 CSCs的培养、纯化与诱导 将出生1～2 d的小鼠置于75%酒精内消毒后剪取心脏，立即置于预先加有DPBS的培养皿中，予DPBS洗去心脏血污后剪成约0.5～1 mm3的组织块，再次用滴管吸取2～3 ml DPBS反复冲洗至洗涤液澄清。弃去洗涤液加入少量CEM培养液（成份：IMDM，10%胎牛血清，100 u/ml青霉素G，100 μg/ml链霉素，2 mmol/L L谷氨酰胺，0.1 mmol/L 2巯基乙醇）使其保持湿润，然后用滴管吸取少量组织块涂布于培养瓶底部并用滴管尖部轻轻拨散使其均匀分布。将培养瓶竖立放入37℃，5%CO2恒温水浴培养箱中25～30 min，待组织块贴壁牢固而又未干涸时加入CEM培养液（覆盖组织块整体）培养。约24 h后肉眼可观察到组织块贴壁牢固极少脱落，于倒置显微镜下可以观察到其周围已有少量成纤维细胞样细胞爬出，48～72 h后可见开始有小而圆的透亮细胞从组织块爬出。予2～3 d换液1次，观察细胞生长情况。约3周左右，细胞增殖至铺满整个培养瓶底，可进行纯化。弃去培养液，以DPBS液清洗2～3次，加入TrypsinEDTA（0.25% tryspsin，1mM EDTA·4Na）于37℃消化约4 min，镜下可见细胞上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] 下一页
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