【摘要】 目的 利用单纯疱疹病毒1型(HSV1)糖蛋白B基因疫苗(pgB)免疫小鼠，观察pgB在小鼠体内的表达。方法 利用pgB肌肉接种方法免疫小鼠，通过免疫组化法检测免疫后2、4、6 w pgB在眼、三叉神经、脑表达HSV1 gB情况。结果 免疫后第2、4、6 w均可见视网膜、三叉神经节、脑组织中大部分细胞核呈棕黄色，免疫组化呈阳性。结论 经肌肉免疫pgB能持续、稳定地在视网膜、三叉神经节、脑组织细胞中表达。
【关键词】 病毒性角膜炎;单纯疱疹病毒1型 ;基因疫苗;糖蛋白B;免疫组化
单纯疱疹病毒1型(HSV1)感染眼部主要引起单纯疱疹病毒性角膜炎、急性视网膜坏死、虹膜角膜内皮综合征等。其中单纯疱疹病毒性角膜炎是当今世界上一种常见的主要致盲性眼病，近年来由于抗菌素和皮质类固醇的广泛应用，其发病率有明显上升趋势，但其发病机制、治疗方法及HSV1的潜伏形式、部位等，一直是眼科界棘手的问题。许多学者认为针对病毒的特异性自动免疫是控制HSV1感染的最有效途径，因此HSV1疫苗是治疗和预防单纯疱疹病毒感染的重要研究方向。本研究利用已构建成功的HSV1糖蛋白B基因疫苗(pgB)〔1〕进行免疫，初步观察其在动物体内的表达情况，为应用pgB进行治疗和预防HSV1在眼部感染奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 HSV1SM44株购自中国药检所疫苗三室，-70℃保存，病毒滴度 TCID50 107.5/ml;Vero细胞由长春生物制品所程晓庚教授惠赠;DMEM培养基、15%胎牛血清、大肠杆菌DH5α及真核表达质粒pcDNA3(吉林大学第一医院中心研究室提供);重组真核表达质粒pgB由本研究的前期工作制备 〔1〕。健康BALB/c小鼠(购自吉林大学基础医学院动物实验室)，雌性，体重(18±2)g，4～6 w龄。
1.2 方法
1.2.1 病毒的培养 Vero细胞培养于含100 ml/L小牛血清的DMEM培养基中，单层细胞形成后，接种HSV1 SM44病毒原液5 μl(TCID50 107.5/ml)，病毒维持液含10 ml/L小牛血清的DMEM，37℃培养。待细胞病理改变达到60%左右时，收获病毒，并离心(2 000 r/min，5 min)，用上清检测TCID50和PFΜ后标明，-70℃冻存备用〔2〕。
1.2.2 质粒的大量提取 将转化有pgB及pcDNA3的大肠杆菌分别划板，在37℃恒温箱内过夜。挑取单菌落，置于150 ml LB液体培养基中，140 r/min、37℃过夜。质粒的提取严格按照无内毒素型质粒DNA大量纯化试剂盒(Vitagene)的说明书进行操作。将最终得到的质粒在紫外分光光度仪下测OD260/OD280和OD260。
1.2.3 质粒的内毒素检测 提纯的质粒pgB和pcDNA3定量分析后，分别取出25 μg用无菌PBS稀释到50 μl，再与终浓度3%氢氧化铝胶悬液1∶1(V∶V)混合，直至全部乳化，鲎试剂检测有无凝集反应。
1.2.4 免疫小鼠〔3〕 BALB/c小鼠随机分为4组，每组30只：A组(实验组)注射含pgB的PBS溶液;B组(阳性组)注射紫外线灭活的病毒液(UV HSV);C组(载体对照组)注射含pcDNA3的PBS溶液;D组(空白对照)只注射无菌PBS(pH 7.4)溶液。
选取肌肉接种的方法。将小鼠双侧大腿内侧肌群用750 ml/L酒精消毒，注射无菌PBS稀释的布比卡因(1.5 mg/ml)每侧100 μl。3 d后进行同部位的多点注射免疫接种：每只鼠每次接种100 μg质粒(溶于0.2 ml无菌PBS溶液)，质粒与终浓度3%氢氧化铝胶悬液1∶1(V∶V)混合，直至全部乳化。间隔3 w，重复接种2次;末次免疫3 w后检测。分别于末次免疫后2、4、6 w断髓处死小鼠10只，进行免疫组化检测。
1.2.5 免疫组化检测〔4〕 取小鼠的眼球、三叉神经节及脑组织固定于10%中性福尔马林液中24～48 h，常规行脱水、透明、浸蜡、包埋，切片。将包埋好的眼球标本，以平行于视神经矢状轴且以其为平面的视网膜进行连续切片，厚约5 μm，放于预先用多聚赖氨酸处理的载玻片上，60℃温箱烤片过夜。切片用于视网膜VEGF免疫组织化学染色(SP法)检测。显微镜下观察并照相。
2 结 果
2.1 质粒大量提取结果 为免疫小鼠而大量提取的质粒pcDNA3及pgB，经紫外分光光度仪测得OD260/OD280分别为1.812 8及1.903 4。经鲎试剂检测无凝
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