4.0 cm者30例。另选取20例因子宫肌瘤行全子宫切除术病人的正常宫颈组织和50例行宫颈锥切手术或活检的宫颈上皮内瘤变(CIN)组织作为对照,其中CINⅠ者18例，CINⅡ～Ⅲ者32例,病人年龄23～67岁,平均42岁。取得的标本迅速置液氮保存备用。所有病人术前或活检前未接受放疗或化疗，临床资料完整。 1.2 主要试剂
DNA提取试剂盒购自上海华舜试剂公司;甲基化修饰及纯化试剂盒购自美国EPIGENTEK公司。
1.3 方法
1.3.1 组织DNA的提取及准备 按DNA提取试剂盒使用说明提取组织DNA，测定波长260 nm处吸光度值与波长280 nm处吸光度比值，确定DNA浓度和纯度。DNA甲基化修饰严格按照试剂盒说明进行。
1.3.2 MSP方法 修饰的DNA应用PCR试剂盒进行巢式双重PCR,按照使用说明进行操作。首轮PCR的引物为:5′GATTAAGATATATTTTAGGGAATATG3′(sense),5′CACCTATATTTTATTCACATAATTTC3′(antisense),扩增片断长为600 bp[2]。PCR反应条件为:反应体积为20 μL;首先94 ℃预变性5 min,然后94 ℃ 30 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35个循环;最后72 ℃延伸10 min。取第一轮PCR产物1.0 μL进行第2轮双重PCR。甲基化特异性引物为:5′CGATTTCGCGGGTTTCGTTC3′(sense),5′AAAACGAACGCAACGCGAAAC3′(antisense),扩增片段长为243 bp,包含9个Cp G岛。非甲基特异性引物为:5′ATTTTGTGGGTTTTGTTTGGTG3′(sense),5′ACTTCCTAACACACCCAAAC3′(antisense)，扩增片段长为140 bp,包含8个Cp G岛。甲基化和非甲基化的引物置于同一个反应中进行扩增,反应条件除甲基化和非甲基化的退火温度为59 ℃ 30 s，25 个循环外,其他均与首轮PCR 条件相同。第2 轮PCR 产物2.0～5.0 μL经过20 g/L的琼脂糖电泳、溴化乙锭染色后,在凝胶成像系统下观察成像结果。双重PCR 产物中,若出现长243 bp 产物则为Syk基因存在甲基化;若出现长140 bp产物,则认为该基因存在非甲基化。
1.4 统计学分析
采用PPMS 1.5统计软件[4]进行统计学分析，计数资料的比较采用χ2检验。
2 结 果
2.1 Syk在正常宫颈组织、上皮内瘤变组织及宫颈癌组织中的甲基化率
宫颈癌组织Syk基因启动子甲基化阳性率明显高于CIN组及正常宫颈组(χ2=17.13、19.71，P<0.01)，CIN组明显高于正常宫颈组(χ2=4.07，P<0.05);而CIN Ⅰ组中Syk基因甲基化阳性率明显低于CIN Ⅱ～Ⅲ组(χ2=6.05，P<0.05)。见表1。
2.3 宫颈癌组Syk基因启动子甲基化与临床病理特征的关系
宫颈癌组中Syk基因启动子甲基化程度与淋巴结转移密切相关(χ2 =10.22,P<0.01);Syk基因启动子甲基化率与病人年龄肿瘤直径、临床分期、组织学分级、病理学类型之间无明显关系(P>0.05)。见表2。表1 各组织中Syk基因启动子甲基化率的比较组别n阳性表2 宫颈癌组Syk基因启动子甲基化与临床病理特征的关系临床病理特征nSyk甲基化阳性(例)阳性率
3 讨 论
宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤，由正常宫颈、CIN到宫颈癌演变是个逐渐发展的过程，早期发现和监测肿瘤的发生、发展对其治疗起关键作用。宫颈癌的发生发展与多种基因和蛋白质的表达密切相关，是一个复杂的多步骤的过程。据报道，宫颈癌的信号传导途径中蛋
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