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经子宫颈冲洗宫腔收集滋养细胞进行产前性别诊断初步研究 |
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赵林淑 宋杰 张爱臣 胡静 黄冰玉 李守柔
孕早期绒毛取样及羊膜腔穿刺取羊水细胞进行产前诊断因对母儿存在一定危险，使其临床应用受到很大限制。因此急需寻找一种安全、可靠的孕早期产前诊断的取材途径。进入90年代，各种现代分子生物学技术已从实验研究向临床应用转化。聚合酶链反应及荧光原位杂交技术的日臻完善，已使从单细胞水平分析胚胎及胎儿遗传性疾病成为可能。最近，国外少数学者采用经子宫颈宫腔冲洗法收集滋养细胞产前诊断部分遗传病获得成功。为了探讨这种产前诊断取材方法的可行性，我们对来我院门诊行人工流产的孕妇85例，在人工流产之前用硅胶导管联接注射器，经子宫颈用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)行宫腔冲洗以回收冲洗液，染色后光镜下检查滋养细胞，并以所取的滋养细胞进行荧光染色查Y小体及提取DNA后聚合酶链反应扩增Y染色体特异DNA，再以人工流产后绒毛标本进行对照。现将结果报告如下。
表1 不同孕周取材成功率
孕周 取材例数 成功例数 (%) 冲洗液中无滋养细胞
5～ 11 9 81.2 0
6～ 30 22 73.3 3
7～ 33 24 72.7 2
8～ 7 6 85.7 0
9～ 4 3 75.0 0
合计 85 64 75.3 5
1 材料与方法
1.1 经子宫颈冲洗宫腔回收冲洗液 任选在我院门诊拟行人工流产术的孕妇85例(孕5～10周)，于术前常规消毒外阴及阴道后用无菌硅胶导管插入宫颈至内口水平，另一端联接装有10ml PBS的注射器，轻轻推注PBS入宫腔，然后缓慢回抽注射器，回收液量0.5～9ml不等，备用。
1.2 绒毛组织取材 同一孕妇于人工流产时，收集术中第1次吸出之绒毛，在无菌条件下挑选少许绒毛枝装入含有5ml Hank's液的试管中备用。
1.3 阿的平荧光染色检查冲洗液中滋养细胞Y小体 将冲洗液加入装有2ml淋巴细胞分离液的液面上，离心20分钟，吸出分离液上的细胞，滴入5ml生理盐水中，清洗细胞两次，离心弃上清，细胞经预温至37℃的0.075mol/L KCl在水浴箱内低渗30分钟，离心后甲醇、冰醋酸(3∶1)固定20分钟及40分钟两次，离心去上清，加入少许新鲜固定液，制成细胞悬液，滴2～3滴悬液于洁净玻片中央，用微火烤干。用0.05%阿的平染液染色20分钟后用Mcllvaine磷酸缓冲液洗片，加盖玻片并用蜡封片，荧光显微镜下观察Y小体。
1.4 按本室常规绒毛组织直接制备染色体法及G显带制片［1］。
1.5 滋养细胞及绒毛组织聚合酶链反应 滋养细胞及绒毛组织按常规酚氯仿法提取DNA、参考文献［2］扩增Y染色体长臂(DYZ)149bp特异片段，引物为Y1.1、Y1.2。经变性94℃60秒，退火55℃90秒，延伸72℃ 120秒，共30个周期。取扩增产物10μl，以溴酚蓝为指示剂，在含1μl／ml溴化乙啶(EB)的2%琼脂糖凝胶上点样电泳2小时、电压2mV，以PGEM tzf(+) Hae Ⅲ作为分子标尺，紫外透射仪下观察。
2 结果
2.1 不同孕周取材成功率 共对85例孕5～10周的孕妇行宫腔冲洗，取得含滋养细胞的冲洗液64例，取材成功率为75.3%，21例取材失败中，16例未能回收到宫腔冲洗液，5例回收液中没有滋养细胞(多发生在实验初期、经验不足)。各孕周取材成功率见表1，经统计学处理χ2=0.84， P＞0.05，无显著性差别。
2.2 35例滋养细胞查Y小体与绒毛组织染色体核型分析结果比较 宫腔冲洗收集的滋养细胞经低渗及固定后，以0.05%阿的平荧光染色后镜检，滋养细胞的细胞核大，为椭园形，呈浅黄绿色；来自母体组织的细胞，细胞核体积小，呈黄绿色。于部分滋养细胞边缘可见一圆钝的黄绿色小亮点，直径约0.25μm，即为Y小体。共发现11例。与同一孕妇人工流产术后绒毛组织制备染色体核型分析结果相比较，绒毛组织核型分析15例46，XY，其中宫腔冲洗有10例出现Y小体，5例未检测到Y小体；20例46，XX中，其宫腔冲洗有1例检出Y小体，19例Y小体阴性。由此可见，宫腔冲洗法收集滋养细胞Y小体检查判断胚胎性别诊断的灵敏度为66.7%，假阳性率为5%。
2.3 29例滋养细胞及绒毛组织PCR扩增Y染色体特异DNA结果比较 PCR扩增产物经电泳后，于紫外透射仪观察。在149bp处出现一条桔黄色亮带即为阳性，否则为阴性。29例滋养细胞及同一孕妇绒毛组织PCR扩增。绒毛组织PCR扩增17例阳性中，其宫腔冲[1] [2] 下一页
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