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用等位基因特异PCR筛查海南汉族人 |
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周代锋 韩建勋 蔡望伟* 周玉英 蔡兰洁 马玉珠 黄元华 徐湘民
β-地中海贫血是我国南方常见的遗传性疾病，其分子基础主要是β-珠蛋白基因点突变导致β-珠蛋白的合成减少或缺如。目前全世界已发现约170种突变，在我国人群中已报道了21种［1］，其中最常见的是下列5种：CD41-42(-CTTT)缺失突变、IVS-2nt654C→T突变、CD17A→T无义突变、TATA盒nt-28A→G突变和CD71-72(+A)移码突变。为了研究海南汉族人的β-地中海贫血的分子基础，我们初步筛查了海南汉族人的β-珠蛋白基因CD41-42(-CTTT)缺失突变。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 DNA样品 用EDTA抗凝，采集新生儿脐带血、末梢血及部分新生儿双亲的末梢血，按Lahiri等方法［2］提取DNA。吸取0.2ml抗凝血，加入等体积低盐缓冲液(10mmol/L Tris-HCl,pH7.6,10mmol/L KCl，4mmol/L MgCl2，2mmol/L ED-
TA)及5μl 20%NP-40，振荡破坏红细胞，5 000r／min离心5分钟，弃上清液，用低盐缓冲液洗白细胞两次，加入100μl低盐缓冲液，7.5μl 10%SDS，54℃保温5分钟；加入37.5μl的饱和NaCl，振荡5分钟，10 000r/min离心10分钟，将上清液吸至另一管中，加入2.5倍体积乙醇沉淀DNA，离心，弃上清液，用70%乙醇洗涤DNA，将DNA溶于100μlTE缓冲液。
1.2 PCR扩增 参照蔡仕萍［3］、刘敬忠［4］等报道合成引物。PCR反应体积为25μl，缓冲液为10mmol/L,Tris-HCl,pH8.3,50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2，0.01%明胶，含模板DNA0.2μg，每种引物浓度为0.2～0.5μmol/L，dNTP浓度为200μmol/L，在MJ PTC-150型DNA扩增仪中扩增，94℃50秒，64℃1分钟，72℃1分钟，重复30次。将扩增产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色在紫外光灯下观察结果。
1.3 反向点杂交 按张基增等［5］的方法进行。于15ml塑料管中加5ml 2×SSC-0.1%SDS溶液，将含ASO探针的膜条浸入，加入PCR扩增产物各20μl。加盖后在100℃水浴中加热5分钟，然后在42℃水浴中保温30分钟，将膜条转入42℃水浴预热的25ml 0.5×SSC-0.1%SDS溶液中振荡10分钟，将膜条再转入20ml 2×SSC-0.1%SDS溶液中(内含5μl Streptavidin-POD,辣根过氧化物酶连链霉抗生物素蛋白，Boehringer mannheim)，在室温振摇15分钟，取出膜条在2×SSC-0.1%SDS溶液和0.1mol/L柠檬酸钠溶液中各短暂洗膜2次，将膜条浸入20ml显色液(含0.1mg/ml四甲基联苯胺和3%H2O210μl，用0.1mol/L柠檬酸钠配制)中，室温下避光静置5～20分钟，阳性结果为蓝紫色斑点。检测下列8种突变：-29A→G，-28A→G，CD17A→T，CD26G→A，IVS-1-nt5G→C,CD41-42(-CTTT)，CD71-72(+A)和IVS-2nt-654C→T。
2 结果
2.1 PCR扩增 正常人DNA样品经PCR扩增后出现一条601bp的扩增片段，而有41-42(-CTTT)缺失突变的样品，除出现601bp片段外，还出现191bp的扩增片段。我们分析了795例海南汉族新生儿脐带血DNA，发现11例出现191bp片段，然后再分析阳性新生儿及其父母的末梢血DNA，进一步证实新生儿存在41-42(-CTTT)缺失，而其父母只有一方有此突变，说明新生儿携带者均为杂合子。此突变在海南汉族人中的携带率为1.38%。
2.2 反向点杂交 11例PCR扩增阳性的标本经反向点杂交分析，证实均为41-42(-CTTT)杂合子，无合并其它7种突变。
3 讨论
β-珠蛋白基因41-42(-CTTT)缺失突变是我国南方β-地中海贫血中最常见的分子缺陷，在海南省黎族人中也相当常见［6］。作者用等位基因特异性PCR筛查759例海南汉族新生儿，发现[1] [2] 下一页
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