NS398通过转化生长因子 Smad信号通路对肾小球系膜细胞环氧化酶2表达的影响

    [Key words]   Glomerular mesangial cell; Inhibitor of cyclooxygenase 2; Transforming growth factor β; Smad2; Cyclooxyge nase 2； Rat

    转化生长因子β（TGF-β）是一种多功能的细胞因子，有3种受体，只有Ⅰ、Ⅱ型是Smad信号通路必须的，具有膜结合丝氨酸/苏氨酸活性[1]。Smad蛋白是目前所知的唯一TGF-β受体的胞内激酶底物，为TGF-β受体后下游的信号转导因子，介导了TGF-β的胞内信号转导[2-3]。TGF-β可促使肾脏ECM沉积，因此它在肾小球疾病进展中的作用得到了许多关注[4]。环氧化酶（COX）是前列腺素合成的重要限速酶，是花生四烯酸转化为前列腺素（PG）的催化酶，在炎症反应中起重要作用。COX-2源性的前列腺素类化合物在肾脏病的发病中有重要作用[3]。研究表明给予选择性COX-2抑制剂—氮-2，环己氧，4，硝基苯-甲基磺胺（NS398）可减少蛋白尿和抑制肾小球纤维化的进展[4]，还可减少残余肾TGF-βm RNA的表达和Ⅲ、Ⅳ型胶原的表达。本文通过研究NS398对肾小球系膜细胞中COX-2表达的抑制作用是否通过TGF-β/Smad信号通路而实现，以探讨COX-2抑制剂的作用机制。

    1   材料与方法

    1.1   试剂配置   按照说明书将TGF-β1粉剂用含1%牛血清白蛋白的4 mmol/L HCl配置成1000 ng/ml的贮存液（pH7.2~7.4），用消毒好的滤器过滤后，分装于1.5 ml的EP管中，-20 ℃保存备用。将NS-398用DMSO配制成1 000 μmol/L，过滤除菌后分装于1.5 ml的EP管中，避光，4 ℃保存备用。用PBS将Staurosporine（Smad2抑制剂）配制成250 nmol/ml，过滤除菌后分装于1.5 ml的EP管中，避光，4 ℃保存备用。使用前以RPMI-1640细胞培养液或PBS稀释成所需浓度，  在临用前新鲜配制。

    1.2   系膜细胞培养和实验分组   系膜细胞的来源：购自上海第二军医大学附属长征医院肾脏病实验室，为大鼠肾小球系膜细胞系。对数生长期的系膜细胞接种于含10％胎牛血清的RPMI1640培养液的60 MM培养皿中，置37 ℃、5 %CO2培养箱中培养，待细胞80%~90% 融合时，用0.25％胰蛋白酶消化后传代培养， 取第4代融合状态系膜细胞调至1×107分别加入50 ml塑料培养瓶和24孔培养板中，待成融合状态时加入无血清RPMI1640培养液同步培养24 h使其进入静止期。分别设（1）对照组；（2）TGF-β（5 ng/ml）组（A组）；（3）TGF-β（10 ng/ml）组（B组）；（4）TGF-β+NS-398 （10 μmol/L NS-398 +10 ng/ml TGF-β） 组（C组）；（5）TGF-β+Staurosporine（5 nmol/ml Staurosporine+10 ng/ml TGF-β）组（D组）；以Staurosporine干预30 min后加TGF-β刺激，加入相应的培养液，每组复设3孔。

    1.3   RT-PCR法检测各组系膜细胞内Smad2、COX-2 mRNA的表达

    1.3.1   细胞总

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