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米非司酮对人绒毛膜癌细胞株体外作用的观察 |
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材料与方法
一、材料
1.瘤细胞：细胞株JAR，为人胎盘绒毛膜癌细胞株，由中国科学院上海细胞生物学研究所提供。
2.药物与试剂来源：四甲基偶氮唑蓝(MTT)购于美国Sigma公司；兔抗人Ki-67抗体由美国Zymed公司提供；卵白素生物素复合物法（ABC）抗兔IgG免疫组化试剂盒，购于北京华美公司；β-hCG酶联免疫试剂盒，由美国Maxim公司提供；米非司酮由上海华联制药厂提供。
二、方法
1.细胞培养：将JAR细胞培养于含10%胎牛血清的PRMI-1640培养液内，0.25%胰酶消化传代。
2.MTT比色法测定：取对数生长期JAR细胞，以1×105个/ml，每孔100 μl，接种于96孔培养板中，于37℃、5%二氧化碳恒温培养箱内培养，24小时后换入分别含有1、5、10、20 μmol/L的米非司酮培养液(实验组)；另设对照组，培养液中含0.2%(V/V)乙醇，置培养箱内继续培养。隔日更换1次同种新鲜培养液，显微镜每天观察细胞生长形态。加入米非司酮5天后，参照温汉平等［4］的方法，经酶标仪以570nm的波长测定各孔吸光度（A）值，同法重复做3个培养板。
3.检测JAR细胞Ki-67抗原的表达：JAR细胞以1×105个／ml，接种于50 ml培养瓶内(每瓶4 ml)，培养24小时后更换培养液。实验组含米非司酮5 μmol/L，对照组含乙醇0.05%(V/V)。继续培养72小时，每组各取5瓶，用0.25%胰酶消化、吹打，制成细胞涂片，按常规方法进行ABC免疫组化染色，封片后显微镜下观察结果，以倪灿荣［5］的标准判断阳性结果。Ki-67阳性细胞均为细胞核着色，表现为细胞核呈棕黄色，或棕色网状，或细胞核内出现许多棕色小颗粒。高倍镜下计数每张涂片上500个细胞内Ki-67抗原阳性细胞数，计算阳性细胞百分率。
4.JAR细胞培养上清液β-hCG的测定：同上述方法，接种JAR细胞于50 ml培养瓶内，实验组及对照组各取5瓶，分别收集第2天及第3天各培养瓶内的细胞上清液，采用酶联免疫法(ELISA)测定其β-hCG含量。每份标本重复测2次，取其平均值，质控符合要求。
三、统计学处理
所得实验数据经SAS统计软件包处理，分别采用方差分析及t检验。
结果
一、米非司酮对JAR细胞杀伤活性的测定
将实验组4种浓度的米非司酮作用于JAR细胞，显微镜观察发现，前2天细胞变化不明显，2天以后细胞增殖逐渐减慢，胞质粗糙，内有颗粒堆积，部分细胞附壁能力下降，继而脱落死亡，碎裂成块。以20 μmol/L浓度的米非司酮作用最明显。而对照组细胞透明，附壁能力好。4种浓度的米非司酮与JAR细胞作用5天，MTT比色法测定结果显示，各浓度米非司酮A值呈不同程度的下降，差异有极显著性（P<0.01）。见表1。
表1 不同浓度的米非司酮对JAR细胞的杀伤率
组别 A值（±s） 杀伤率(%)
实验组(μmol/L)
1 1.118±0.109 12.86
5 0.933±0.107 27.28
10 0.488±0.106 61.96
20 0.344±0.049 73.19
对照组 1.283±0.122
注：实验组与对照组比较，实验组间两两浓度比较，P均<0.01
二、米非司酮对JAR细胞Ki-67抗原表达的作用
免疫组化染色结果显示，实验组5 μmol/L的米非司酮与JAR细胞作用72小时，Ki-67抗原表达阳性率为(46.59±2.44)%；而对照组为(63.88±2.83)%，实验组细胞Ki-67抗原阳性率较对照组明显下降，差异有极显著性（P<0.01)，见图1，2。
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