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糖皮质激素对大鼠未成熟肺PDGF mRNA表达的调节 |
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at lungs. Dex could regulate mRNA expressions of PDGF-BB and PDGFR-α chains, but did not show significant effect on mRNA expression of PDGF-A and PDGF-β chains in late fetal rat lungs. Conclusion The expressions of PDGF and PDGFR were associated with the development of rat lungs, and changed at different stages of gestation. Glucocorticoid can regulate the gene expressions of PDGF-BB and PDGFR-α chain in fetal rat lungs.
【Key words】 Glucocorticoids Platelet-derived growth factor RNA, messenger Gene expression Rats Lung
新生儿呼吸窘迫综合征(newborn respiratory distress syndrome, NRDS)是新生儿时期重要死因之一。研究表明糖皮质激素(glucocorticoid, GC)有预防NRDS的作用，但临床应用效果不十分理想，机理也不尽清楚，可能有生长因子参与的作用。国外研究血小板源生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)对胎肺发育起重要作用，国内未见报道。GC对肺组织，尤其是胎肺组织PDGF表达的调节也未见报道。本研究探讨GC促进肺成熟的机理，为今后临床防治NRDS提供一定的实验与理论依据。
材料和方法
一、实验大鼠
清洁级孕18、19、21天(足月22天)、新生及成年大鼠，体重分别为0.9～1.0 g，1.3～1.5 g，3.0～3.5 g，5.0～6.0 g及220～250 g。
二、肺总RNA提取
分别将18、19、21天孕鼠迅速处死，低温无菌条件下剖宫取出胎鼠分离肺组织(新生及成年鼠处死后直接分离肺组织)，快速剪成约1 mm×1 mm×1 mm小块，匀浆。用异硫氰酸胍一步法抽提肺总RNA；部分组织块用无血清培养(wayonuth′s培养液)，并加入刺激物地塞米松(Dex)(10-7 mol/L)置37℃ CO2箱内(95%空气，5%CO2)培养48小时后，同法提肺总RNA。经吸光度测定，计算含量。
三、探针来源及标记
大鼠PDGF-AA(Sal Ⅰ-EcoRⅠ 233 bp)、PDGF-BB(BamHI-EcoRI 398 bp)、血小板源生长因子受体(PDGFR)-α(EcoRI-BamHI 348 bp)、PDGFR-β(pstI-EcoRI 478 bp)cDNA探针由加拿大Martin Post博士惠赠。将克隆有cDNA探针的质粒酶切线性化后，经酚、氯仿：异戊醇(24∶1)抽提纯化，无水乙醇沉淀并离心回收。采用Riboprobe Gemini Ⅱ core system试剂盒(Promega产品)和α32P-UTP(Amersham)合成及标记反意义链RNA探针。
四、溶液杂交
准确定量RNA样品20 μg，经无水乙醇沉淀、离心回收后，加于含2×10 cpm 32 P标记的RNA探针的25%甲酰胺的杂交液中，45℃杂交过夜。次日在各反应管中加入RNase，酶解去除未杂交的单链RNA。抗RNase的杂交片段经8%聚丙烯酰胺变性凝胶(含8 mol/L尿素)电泳分离。电泳胶以保鲜膜覆盖后，与Kodak x-o-mat胶片-70℃放射自显影。
五、杂交结果的定量分析和统计学处理
放射自显影的X线经MIAS-300医用图像分析系统处理得灰度值。所得结果用q检验进行统计学分析。
以上从RNA提取到杂交的整个试验过程至少重复3次，并以GAPDH(Sau3AI-BstxI 110 bp)探针同时杂交作为内参。
结果
一、PDGF与PDGFR mRNA在大鼠未成熟肺、新生鼠及成年鼠肺中的表达
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