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人正常食管黏膜上皮细胞的纯化分离和传代培养 |
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养3代，由于传代后贴壁细胞数迅速递减，而不能继续增殖传代. 两组从原代培养到以后的各代均未发现有成纤维细胞生长.
2.2细胞生长曲线接种密度为1.1×104个/cm2时，KSFM中细胞群体倍增时间(PDT)为(51.5±11.5) h (n=3). 但含血清组细胞增殖缓慢，由于传代后帖壁细胞数迅速递减而不能计算PDT. 生长曲线见Fig 1.
2.3细胞贴壁性在KSFM中原代和第1代细胞种植24 h后贴壁细胞数与接种细胞数之比分别为(75±8)%和(105±4)%， 在含血清培养基组中分别为(37±15)% 和(56±8)% (n=3), 两组对照，有显著性差异（P<0.01）. 接种1 d, 胰酶消化时间约为（2~3） min, 后随着接种生长时间的延长消化时间即延长，接种7 d，消化时间为(10~15) min. 无血清组不同生长天数细胞经消化后，重新接种，其贴壁情况见Fig 2，不同时段贴壁细胞百分数之间存在显著差异（P<0.01），以d 3, 4消化后重新接种后贴壁细胞百分数较高.
2.4免疫细胞化学染色细胞爬片染色后，两不同培养基组爬片中均见到CK14和CK13阳性细胞（Fig 3），而未见到波形丝蛋白阳性细胞. 无血清培养基组于d 1, 3, 5, 7的CK14阳性细胞百分率均较同时间对照的含血清培养基组为高，(其中d 3, 5, 7有统计学差异，P<0.05)；并两组内阳性细胞百分率随生长时间增加而减少；而CK13阳性细胞百分率的波动恰于其相反(Fig 4).
3讨论
我们通过改变原代取材时的消化酶，通过不同培养基间的比较，从而使食管黏膜上皮的原代及传代培养均获成功，并克服成纤维细胞污染，不能传代扩增或传代次数较少，细胞数量较少等问题. 黏膜上皮细胞培养关键的一步是上皮细胞与成纤维细胞的分离，有效的分离可避免成纤维细胞的污染. Dispase是一种中性蛋白酶，用于人皮肤表皮细胞的培养中，其作用于表皮与真皮结合处，破坏半桥粒结构，使基底细胞层底部完整分离［5］. 从本实验可见，dispase亦可成功地将食管黏膜层中的上皮层和固有层分离开，所获的上皮层再经胰酶消化后，就得到了不含成纤维细胞的黏膜上皮细胞，达到了细胞的纯化. 抗波形丝蛋白（间充质特有蛋白）mAb组化反应阴性，也说明了分离培养的食管黏膜细胞中无其他类型细胞的掺杂污染.
食管黏膜上皮细胞在添加了100 mL/L FBS的KSFM中贴壁和扩增能力均较在单纯KSFM为低. 角蛋白是上皮细胞的骨架蛋白，CK14仅表达于基底层细胞［6］，CK13是食管上皮复层分化相关标记，仅表达于基底层上细胞的胞质中. 结果见含血清培养基组中基底层细胞比例明显较低，基底层上细胞数量增加，并可改变上皮细胞单层生长的状态，促进部分细胞呈复层生长，说明血清明显促进细胞分化. 正因此，血清影响了细胞大量扩增，不利于食管黏膜上皮多次传代培养. 在KSFM中，由于接触抑制，接种后5 d，细胞即进入生长停滞期，分化细胞亦突然明显增加，细胞趋于老化. 不同生长时期的细胞消化后再接种，其贴壁性能亦不同. 在传代接种中，基底层细胞具有较强贴壁性，分化细胞贴壁性较低, 分化细胞不能传代, 我们探讨出一种培养食管黏膜鳞状复层上皮的新方法. 分化细胞如何培养，如何诱导或控制细胞分化等尚需要进一步研究.
【参考文献】
［1］ Corinna PW, Michael TB, Patricia CG, et al. Genetic analysis of longterm Barretts esophagus epithelia culture exhibiting cytogenetic and ploidy abnormalities ［J］. Gastroenterology, 1998; 114(2): 295-304.
［2］ Garewal HS, Leibovitz A, Sampliner RE, et al. Tissue culture of epithelial cells from esophageal specialized columnar epithelium (Barretts esophagus) ［J］. Digestive Diseases and Sciences, 1992; 37(4): 532-536.
［3］ Rebacca CF, Michael JG, George T. Novel adaptation of brush cytology techniqu上一页 [1] [2] [3] [4] 下一页
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