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人正常食管黏膜上皮细胞的纯化分离和传代培养 |
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增加而减少；CK13阳性细胞则恰与其相反；两组中均未见波形丝蛋白阳性表达. 结论： Dispase消化分离细胞， KSFM作为培养基是食管鳞状上皮可靠的新培养方法.
【关键词】 食管；上皮细胞；细胞培养
0引言
目前食管黏膜的传代培养，就报道的极少的几种方法还存在着很多问题，比如大量的成纤维细胞污染［1］，不能传代扩增或传代次数较少［2］，细胞数量较少. 我们通过改善原代取材时消化方法，进行含血清及不含血清培养基比较研究，探讨出能获得大量细胞的新的正常食管黏膜细胞的培养方法.
1材料和方法
1.1材料
人角朊细胞培养液（KSFM, Gibco）， 胰酶（Sigma）, DMEM(Hyclone), Dispase (Gibco)，胎牛血清（杭州将滨生物技术有限公司）. SP免疫组化染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，单可隆抗体细胞角蛋白14、13（CK14, CK13）和波形丝蛋白(vimentin)抗体购自上海长岛生物有限公司. 从3例新鲜（仅离体数分钟）食管手术标本上选取正常黏膜标本，浸入4℃ PBS中，当日即进行原代培养. 标本获取均经患者同意，并签订同意书.
1.2方法
将食管黏膜组织放入添加20万u/L青霉素、200 mg/L 链霉素和1.5 g/L庆大霉素的PBS中充分洗涤到无血迹后，洗必泰消毒，后依次采用如下方法消化分离获取黏膜细胞. 4℃条件下标本在2.5 g/L 中性蛋白酶（dispase）中消化18~24 h后，用眼科镊将黏膜层撕下，放入2.5 g/L胰酶中，37 ℃消化5～10 min. 其后加入等量的含100 mL/L胎牛血清的DMEM终止消化，吹打，成单细胞液，离心，PBS清洗后接种. 静置于37℃，50 mL/L CO2培养箱中，24~48 h后观察细胞贴壁情况，弃取原培养基，其中含未贴壁细胞，加入新鲜培养基后继续培养. 上皮细胞铺满培养皿底的75%，加EDTA的2.5 g/L胰酶消化后可传代. 设无血清培和含血清两种培养基进行对照观察［3,4］. 无血清者成分为：KSFM，每500 mL含0.9 mL牛垂体提取物（bovine pituitary extract,
BPE）, 0.438 g L谷氨酰胺, 3 μL 生长因子（EGF）; 含血清者在前者的基础上加入100 mL/L胎牛血清，其余成分相同. 余实验方法和实验条件相同. 为结果有可比性，本实验中接种细胞均为在KSFM中生长的细胞. 选取第2代细胞，24孔板接种，观察7 d，绘制两种培养基中细胞的生长曲线. 按最适密度接种，计算两组原代接种后48 h，第1代接种后24 h贴壁细胞数. 选取KSFM中为计算生长曲线而消化下的细胞，以1×104个/cm2重新接种，培养基为KSFM，24 h后将已经贴壁的细胞胰酶消化，并计数. 计算贴壁细胞百分比（贴壁细胞数/接种细胞数×100%），观察不同生长时段细胞的贴壁能力. 细胞生长在载玻片上, 用650 mL/L冷丙酮固定20 min, 细胞免疫组化法检测两不同培养基组第2代接种后1, 3, 5, 7 d的细胞CK14, CK13及波形丝蛋白的表达情况. 实验步骤中不加一抗改加PBS为空白对照. 采用如下方法进行半定量比较：在显微镜（×400）下，计算相邻20个视野内的阳性细胞，计算阳性细胞百分率.
统计学处理： 运用t检验、方差分析对结果进行统计学分析.
2结果
2.1食管黏膜上皮细胞的特性食管黏膜细胞原代接种于培养瓶中，均从4~6 h开始出现细胞贴壁生长，此过程多持续48 h以上. 贴壁细胞变成卵圆形，有突起形成，边界不清楚,并且细胞胞质透亮. 其后即出现分裂增殖. 原代培养的上皮细胞最适接种密度（4~6）×104个/cm2，传代培养的最低接种密度［5］大于1×103个/cm2才能形成克隆，最适接种密度为（1~4）×104个/cm2. 选择最适的接种密度，细胞于4~5 d进入生长平坦期，生长至培养瓶的70%~80 %，需要传代. 无血清培养基组，细胞呈卵圆形，单层生长，呈铺路石样；第1~5代，细胞大小均一，呈卵原形，第5~6代以后，出现巨型细胞及长梭形细胞，占3%~5%，后随传代数增加巨型细胞增加. 本实验已传代达15代，细胞仍具有较好状态，80%细胞胞质透亮，形态呈卵圆形，后未再继续传代培养. 血清培养基组，细胞成多角形，出现复层上皮. 消化后的细胞成团块状及细胞片较多，并且不易吹打散开. 血清培养基组仅培上一页 [1] [2] [3] [4] 下一页
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