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异丙酚对过氧化氢所致的血管内皮细胞损伤的保护作用 |
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mu;mol/L异丙酚和过氧化氢组(P12.5+H２O２组)；⑦25μmol/L异丙酚组(P25组)；⑧25μmol/L异丙酚和过氧化氢组(P25+H２O２组)；⑨50μmol/L异丙酚组(P50组)；1050μmol/L异丙酚和过氧化氢组(P50+H２O２)。上述过氧化氢终末浓度为2μmol/L，脂肪乳剂取90μmol/L约等同于50μmol/L异丙酚中所含脂肪乳剂的量。
2.实验：按上述分组，在相应组中加入不同浓度的异丙酚或脂肪乳剂，置于CO2掊养箱中孵育20分钟，再在相应组中加入过氧化氢终末浓度为2μmol/L置于培养箱中20分钟，取100μl上清作LDH测定，余下上清及细胞经冰浴中超声粉碎后用荧光分光光度法、化学发光法及紫外分光光度法分别测定TBARS含量，SOD和CAT活性，考马斯亮蓝法作蛋白定量。
3.LDH释放率的计算〔3〕：
LDH释放率=(实验组LDH-自然释放LDH)/(最大释放LDH-自然释放LDH)×100%
4.H２O２浓度的标定：于紫外分光光度计240nm处测其吸光度，再计算〔4〕：
浓度(mmol/L)=Abs×1000/39.4
5.统计学处理：数据用均数±标准差表示。计量资料的比较用方差分析(ANOVA)，样本率的比较经平方根反正弦转换后采用方差分析。P＜0.05认为有显著差异。
四、形态学观察：上述处理的细胞作光镜下观察，另取细胞分4组，①正常对照组；②过氧化氢组；③脂肪乳剂和过氧化氢组；④25μmol/L异丙酚和过氧化氢组。各组处理及过氧化氢和脂肪乳剂浓度与“三”相同。处理后收集细胞，常规电镜制样，HITACHI H-600电子显微镜下观察细胞超微结构的改变。
结果
一、异丙酚对氧化氢所致的血管内皮细胞损伤的影响见附表。3个浓度的异丙酚(12.5、25、50μmol/L)明显地减轻了H２O２所致的细胞损伤，表现为较低的LDH释放率，较高的SOD和CAT活性，并几乎完全地抑制了内皮细胞TBARS的产生。上述保护作用并非是异丙酚的溶剂脂肪乳剂的作用。
二、形态学观察
1.相差显微镜下形态：正常对照组细胞为多角形，排列紧密镶嵌，细胞明亮，胞核圆或卵圆形，内有核仁，呈典型的鹅卵石铺路样生长。过氧化氢损伤组可见单层内皮细胞明显肿胀，排列松散，可见部分细胞脱落，漂浮，镜下可见大片细胞脱失区(图1)。而异丙酚保护组上述改变明显减轻，且未见细胞脱失(图2)。
2.透射电镜下观察细胞超微结构的改变：过氧化氢组和脂肪乳剂与过氧化氢组血管内皮细胞异常肿胀，可见核内染色质溶解，胞质内粗面内质网异常扩张，线粒体空泡化，胞质内基质透明，游离核糖体疏散稀少(图3)。而25μmol／L异丙酚与过氧化氢组细胞超微结构基本正常，但线粒体出现不同程度的肿胀(图4)。
讨论
在一些病理状态下，如严重创伤、休克、感染、缺血再灌注等，因H２O２半衰期长，能自由弥散通过细胞膜，而成为对组织器官造成损伤的重要的活性氧，尤其是对血管内皮细胞的损伤，在上述病症的发生发展过程中，起着不容忽视的作用〔5〕。目前认为，过氧化氢对血管内皮细胞的损伤机制有如下几个方面：①H２O２能穿过细胞膜进入细胞内，导致ADP磷酸化的醣酵解或线粒体途径的某些酶失活(如3-磷酸甘油醛脱氢酶)，使细胞内ATP含量降低，细胞能量代谢障碍，同时细胞外黄嘌呤大量堆积，在黄嘌呤氧化酶的作用下，可产生大量的氧自由基，形成恶性循环；②H２O２在亚铁离子存在条件下，发生Fenton｀s反应，生成毒性更强的羟基；③H２O２和蛋白酶的协同杀伤作用，其机理不详，推测可能是两者促进了超氧阴离子的产生〔6〕。
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