视神经半损伤后复合神经营养因子辅助再生的动态生物学研究

    1.1.2  实验试剂  ①试剂：尼氏(Nissl)染色试剂为焦油紫(Kresylechtviolet)，固蓝（Fast Blue）由Leipzig化学公司提供。BDNF和CNTF生物制品由Regenron Phrmaceuticals of NY公司提供。②主要仪器：图形视觉诱发电位（pattern reversed visual evoked patential，PVEP）动态检测仪，冰冻切片机、CQ-970型计算机图像分析仪、Leica双目自动照像显微镜、脑立体定位仪等。

    1.2  实验方法

    1.2.1  动物模型制作方法  以眶外侧入路方法手术开眶，暴露术眼球后ON，在眼球后5 mm处应用宝石卡尺手术刀准确行ON的1/2切断。术后4组动物在正常视环境中共同饲养1、4和8~12个月， ON1/2切断并于玻璃体内注射BDNF和CNTF辅助再生组在术后即日注射BDNF和CNTF复合液(10 ng)，并在以后每周注射BDNF和CNTF复合液2次。在ON损伤后第1、第4和第8个月时，3次行PVEP动态检测，然后将动物处死，切取眼、视神经和外侧膝状体做组织学处理。

    1.2.2  实验动物灌注固定和取材  实验动物在饲养到第1、第4和第8个月时，进行PVEP检测[1]，在视觉电生理实验后分批灌注固定实验猫并快速取材。①动物麻醉后行开胸并剪开心包膜，右心室切开放出心血管系统血液，快速切开左心室并经左心室主动脉插管灌注生理盐水冲洗心血管系统，接着快灌注4℃冷固定液(4%多聚甲醛磷酸缓冲液，pH值为7.2)，再慢灌注1000 ml含4%多聚甲醛、0.5%戊二醛和0.2%苦味酸的4℃磷酸缓冲溶液(pH值为7.2) 2 h。在4℃冰箱放置过夜后，标本块转至15%蔗糖溶液(PBS pH值为7.2)中浸泡12 h，待标本块下沉后由液氮速冻后行切片。②标本取材顺序为：a、眼球后2~4 mm处切取视神经。b、冠状切取同侧和对侧LGN组织。c、ON横截面行Fast Blue染色程序，LGN行冠状切片并行Nissl染色。d、酒精梯度脱水，Hemo-De透明，DPX封固。e、在光镜下观察计算机图像。

    1.2.3  图像分析组织学结果  组织细胞化学结果分析程序：参照细胞构筑学特点，将4组内每只幼猫同侧和对侧LGN冠状切面平铺片各取5张，每张组织切片选取5个视野计数，在QTM970型图像分析仪的10×40倍光镜视野下，测量上述解剖部位单位面积内的神经元数密度(numberical density，ND)，数密度用染色阳性细胞数/视野内面积表示。ON横切面轴突纤维计数采用ON横切面分区法：首先，将ON横切断面组织切片在放大20倍的光镜下进行分区，共计分成8个区。在ON最大直径处划一条水平直线，在水平直线中点划一条与其垂直的纵行直线。然后，通过中心作与水平直线成45°角的两条斜线，此将ON横切面分为8个区，在每一区内随机选4个视野计算单位视野面积（mm2）内的ON轴突数量。每一ON横切断面的RGCs轴突总数为8个分区单位视野面积（mm2）内的ON轴突数量的均数计数之和，每个实验组共计数10张ON横切断面组织片， 按上述ON横切断面组织片分区法测量其单位面积内的ON纤维数ND。

    1.2.4  统计学方法  应用t检验进行统计学分析。

    2  结果

    2.1  各实验组ON横断切面组织片形态学变化与RGCs轴突计数  ON横断面切片经固蓝（Fast Blue）染色后暴露了典型的RGCs

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