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STR位点D19S253和D8S1179的多态性研究 |
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短串联重复序列(STRs)属微卫星DNA序列，重复单位2～7bp。STR位点在人类基因组中含量丰富，估计三核苷酸重复和四核苷酸重复STR多态位点约有20万，平均每隔15～20kb就出现一个［1］。运用聚合酶链反应(PCR)技术可扩增并获得STR位点的多态片段。90年代以来，STR多态位点已成为一类重要的遗传标记系统应用于法医学个人识别和亲子鉴定。
我们应用PCR和PAG垂直电泳技术结合银染方法研究了D19S253和D8S1179两个四核苷酸重复STR位点的多态性。调查了湖北省武汉地区200多名汉族无关个体，首次获得两个位点的汉族频率分布，计算出两个位点的杂合度(H)、个人识别能力(PD)、多态性信息含量(PIC)和非父排除率(MEC)。通过家系调查分析了各多态片段的传递规律，观察了100次减数分裂未发现突变基因。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 血样 233名汉族无关个体的EDTA抗凝血由武汉同济医院血库提供。一个3代6口人家系血样以及50例经常规血型测定确定亲生关系的父、母、子静脉血样从本室亲子鉴定案例中收集。
1.2 DNA提取 按Erlich介绍的细胞裂解／蛋白酶K DNA抽提法提取DNA［2］。
1.3 PCR扩增
1.3.1 两位点特异性寡核苷酸引物均由Bio-tech公司合成，引物序列如下：D19S253位点引物［3］为A：5′ATAGACAGACAGACGGACTG3′；B：5′-GGGAGT-
GGAGATTACCCCT3′。D8S1179位点引物［4］为A：5′TTTTTGTATTTCATGTGTACATTCG3′；B：5′CGTAGCTATAATTAGTTCATTTTC3′。
1.3.2 PCR扩增体系 总体积20μl，内含200μmol/L dNTPs，50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl pH8.3，1.5mmol/L MgCl2，0.5U Taq DNA 聚合酶，模板DNA 2μl(约50ng)，D19S253位点引物A和B的浓度各为0.1μmol/L，D8S1179位点引物A和B的浓度各为0.25μmol/L。
1.3.3 PCR热循环条件 扩增在Hema-480型基因扩增仪(中国珠海)上完成，热循环参数分别为D19S253位点： 95℃ 2分钟，然后94℃ 45秒／55℃ 30秒／72℃ 30秒D8S1179位点：95℃ 2分钟，然后93℃ 30秒／58℃ 75秒／72℃ 15秒。两位点扩增均为30个循环，最后一个循环均延伸10分钟。
1.4 电泳分离 PAG的凝胶浓度(T)=6%，交联度(C)=5%(含4mol/L尿素及0.5×TBE缓冲液)，凝胶大小230mm×200mm×0.6mm。在每管20μl扩增产物中加入20μl 2×STR载样缓冲液(10mmol/L NaOH，95%甲酰胺，0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯蓝FF)，混匀后取1μl加样，另加1μl Φ×174／Hae Ⅲ作为片段长度标准对照，电泳缓冲液为0.5×TBE，恒压400V电泳2小时。
1.5 等位梯阶的制备 将5个具有不同基因型的杂合子个体的染色体DNA浓度调整至相同后，各取相同体积混匀，取4μl混合物按上述条件扩增，其产物即为含9个等位基因的等位梯阶标准对照。
1.6 银染 按Bassam等［5］介绍的银染法染色。
1.7 统计学计算 对每人样品逐个分型并记录每个个体的基因型，计算基因频率，并对基因型分布作卡方检验。按有关公式分别计算杂合度、杂合度及基因频率标准误［6］、个人识别能力及其标准误、联合PD值及其标准误［7］、多态性信息含量［8］、非父排除率及累积非父排除率［9］等与法医学相关的统计量。
1.8 对一个3代6人家系作D19S253和D8S1179位点分型。对50例已确定亲生关系的父、母、子真三联(RCP99%)进行D19S253和D8S1179位点分型。
2 结果
2.1 225例汉族无关个体的D19S253位点分型及233名汉族无关个体的D8S1179位点分型都十分明确，均检出9个等位基因，按重复单位重复数命名为7、8、9、10、11、12、13、14、15(D19S253位点)及11、12、13、14、15、16、17、1上一页 [1] [2] [3] 下一页
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