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PKA对跨膜型和分泌型TNF |
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TNF-α可有效杀伤对sTNF-α耐受的肿瘤细 胞［1］；而且二型TNF对TNF受体作用有各自特征［2］。提示二型TNF的受体 后信号传导有差异。本研究旨在比较PKA对二型TNF胞毒效应的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,E.coli 0127:B8 ,Difco,美国)；TNF-α单克隆抗体(邦定公司)；Forskolin、H8、碘化丙啶(PI)和Hoechst3 33258购自Sigma公司，美国。
1.2 细胞培养 以HepG2(人肝母细胞瘤)、MCF-7 (人乳腺癌)、HL-60(人急性前髓 细胞性白血病)、K562(红白血病)、Raji(B 淋巴细胞性白血病)、L929 (鼠成纤维母细胞)作为靶细胞。全部细胞用含15%FCS的RPMI1640 完整培 养基培养。
1.3 TNF-α的诱生、获取及活性测定 取健康成人静脉血，用常规方 法分离单核细胞。105单核细胞与LPS(100 ng/ml)共培养16 h，取上清获得sTNF-α；而 细胞则用1%多聚甲醛室温下固定15 min，用PBS洗3次后，继续在培养液中培养12 h，以 去除残留的sTNF-α，从而获得mTNF-α。
1.4 TNF-α生物活性检测 取104靶细胞加入稀释培养上清，以检测sTNF-α；测定mTNF-α时，则按效：靶比例10∶1，向固定效应细 胞加入靶细胞，总反应体积为100 μ1/孔，37℃培养48 h后，每孔加入25 μ1的0.5%MTT， 继续培养4 h，弃上清，向孔内加入100 μ1裂解液(50%二甲基甲酰胺，20%SDS)，37℃摇荡1 6 h后，在波长570 nm下测吸光度。按以下公式计算TNF-α的胞毒效应(即细胞死亡百分率) ：
用抗TNF-α的单克隆抗体可完全拮抗二型TNF-α的胞毒效应，从而证实 其特异性。
1.5 流式细胞仪定量检测细胞凋亡和坏死 收集TNF处理细胞，离心 后，用PBS洗3遍，加入Hoechst 333258 (1 μg/ml)，37℃水浴7 min，迅速置冰上10 min 。用PBS洗1次后，再用5 μg/ml的PI染液悬浮细胞，置冰 上避光染色10 min，400 r/min离心5 min，用PBS洗2遍后，将细胞悬浮于500 μ1 P BS中，上机检测10 000个细胞。利用双标记及散射参数可将正常、坏死与凋亡细胞区分开。
2 结果
2.1 PKA激活剂对二型TNF-α胞毒效应的影响 图1显示mTNF-α可 杀伤实验所用6株靶细胞，但sTNF-α则仅能杀伤其中2株。用PKA激活剂Forskolin(10 μmo l/L)可增强sTNF-α对MCF-7和L929的胞毒活性(P＜0.001)，却不能逆 转其余4株靶细胞对sTNF-α的耐受。将Forskolin的浓度增加10倍，仍无效 (结果未显示)。与sTNF-α不同，PKA激活剂对mTNF-α胞毒作用均无明显影响(P＞0.05)。
图1 PAK激活剂对sTNF-α或mTNF-α细胞毒作用的影响
Fig.1 The effect of PKA activator on
the cytotoxicity of sTNF-α or m TNF-α
2.2 PKA激活剂对sTNF-α介导靶细胞死亡方式的影响 图2显示sTNF-α对MCF-7的胞毒效应几乎完全表现为坏死，而PKA激活剂Forskolin不但使 sTNF-α胞毒效应增强，而且使该靶 细胞近42%的坏死转变为凋亡。对L929亦是如此，PKA激活剂使sTNF-α引起的坏死比例降低 (由35.4%下降为26.8%)，而凋亡比例增加(由20.8%上升至40.9%)。
图2 PAK激活剂对sTNF-α引起靶细胞死亡方式的影响
Fig.2 The effect of PKA activator on the
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