TCGC，引入Nde I切点；3′-引物为GCGGGGATCC-TTAGTGATGGTGATGGTGAT。为添加c-Myc-抗原决定基，合成如下2条寡核苷酸：5′-CTAGTGAACAAA-AACTCATCTCAGAAGAAGATCTGGCTAGCG和5′-CT-AGCGCTAGCCAGATCTTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTT-CA，2条链有38个碱基互补，经退火形成的双链含有c-Myc十肽(EQKLISEEDL)的编码序列［6］，其两端为Spe I和Nhe I的粘性末端。以上引物均通过赛百盛公司由美国CyberSyn公司合成。
1.3 PCR等基因工程操作参照文献［7］进行。
1.4 抗HBsAg单链抗体在大肠杆菌中以IPTG对含pT7SC的重组菌株BL21(DE3)进行诱导表达，不同时间取样进行检测。
1.5 表达产物的活性测定
1.5.1 竞争性抑制ELISA 用HBsAg包酶标板，ScFv与HBsAg噬菌体抗体的竞争性结合按公式计算：抑制率=(OD对照-OD样品)/OD对照×100%。
1.5.2 间接ELISA 通过c-Myc十肽进行检测，以HBsAg包板，待测样品孵育后加入1∶1 000稀释的9E10腹水，37℃孵育后加入适当稀释的HRP-抗鼠IgG进行反应，最后用OPD底物显色。
1.6 SDS-PAGE按常规方法进行。
2 结果
2.1 高效表达载体pT7SC的构建 为将抗HBsAgScFv表达载体pHBSCS中的ScFv基因重组到pT7中，我们设计了一组引物，可将ScFv基因及其ompA前导序列和3′端的组氨酸尾巴通过PCR扩增得到约860 bp的产物，以Nde I加Sal I位点定向克隆入pT7载体中，得到表达载体pT7SC。
2.2 pT7SC所表达的ScFv的活性测定 将pT7SC转化BL21(DE3)细胞，转化菌经IPTG诱导不同时间后，用竞争抑制性ELISA检测培养上清中表达产物的抗原结合活性，发现培养上清中抗原结合活性随诱导表达时间增长而增加，到诱导表达4 h后逐渐持平，抑制率最高可近50%。
2.3 ScFv的高效表达 将上述IPTG诱导不同时间后的细菌沉淀进行SDS-PAGE分析，从诱导表达0.5 h开始即在28 kD左右出现一诱导表达带，随时间增长，该表达带增多，在3.0～6.0 h基本保持平稳，而空载体对照则无此诱导表达带。用UVP公司Gelbase-Pro软件对电泳结果分析发现，在诱导表达后0.5 h时，表达量占菌体总蛋白的10%以上，在2.0～6.0 h时表达量可达菌体总蛋白的28%左右，如图1。
2.4 pT7SCM的构建及表达 由于ScFv不含有Ig恒定区，不能用一般抗Ig进行检测，为使ScFv便于检测，我们合成了编码c-Myc十肽的寡核苷酸，将其组装到p7TSC的VH基因和聚组氨酸之间，得到表达载体pT7SCM，该c-Myc十肽是一确定的抗原决定基，可被单克隆抗体9E10特异性识别［6］，将pT7SCM转入BL21(DE3)菌株，经IPTG诱导不同时间后获取上清，进行ELISA实验，证明可用9E10检测出ScFv与HBsAg的结合活性。
图1 经IPTG诱导后细菌的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
Fig.1 SDS-PAGE analysis of induction expression
Note:M.MW marker;1-8. samples after induction for 0.0,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 and 6.0 h;9.pT7 vector control(3 h induction)
3 讨论
单链抗体是基因工程抗体家族中的一个重要成员，有多种优点及较好的临床应用前景，可在大肠杆菌中高效表达，从而为通过发酵大量制备单链抗体提供了条件。本文利用T7 RNA聚合酶启动表达体系得到了抗HBsAg ScFv的高效表达，表达量达菌体总蛋白的28%。在构建pT7SC时保留了原ScFv基因5′端的ompA信号序列，优点是：(1)由于它是细菌本身的蛋白，易于被宿主菌识别，使外源基因获高效表达；(2)可同时产生ScFv的分泌型表达产物，在细菌培养上清中得到有功能活性的蛋白分子，利于检测。我们用ELISA测到培养上清中的抗体活性也证明这一点。在细菌内外源基因表达量很高时，大部分表达产物以不溶性的包涵体形式沉积在菌体内，这种情况下信号肽仍能被正确切除［8］。形成
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