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猫脊髓后角浅层内GABA能神经终末与表达阿片 受体神经元之间的突触联系 |
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龚良维 丁玉强 郑恒兴 王 丹 秦秉志 李继硕
(第四军医大学解剖学教研室，梁銶琚脑研究中心，西安 710032)
摘 要 为了研究GABA与MOR在吗啡镇痛中的相互关系，用包埋前免疫组织化学方法结
合包埋后胶体金电镜技术，观察了猫脊髓后角浅层内γ-氨基丁酸(GABA)能轴突终末与表达阿片μ受体神经元之间的突触联系。结果表明，后角浅层内约有三分之一的MOR阳性树突和胞体与GABA阳性终末形成突触连接，这些突触均为对称性突触。本实验结果提示猫脊髓后角浅层内MOR阳性神经元的功能活动可能受到突触前成分释放的GABA的影响。
关键词 阿片μ受体 GABA电镜 免疫组织化学 脊髓 猫
γ-氨基丁酸(GABA)是哺乳动物中枢神经系统内的一种抑制性神经递质［1］。脊髓后角浅层内存在大量的GABA能终末［2］，其主要来源为本节段和其他节段的GABA能中间神经元的终末、脑干的GABA能神经元的下行投射纤维及外周初级传入纤维。以往的研究表明GABA在脊髓水平对伤害性刺激具有抑制作用[3]。如离子微电泳或静脉注射GABA可选择性地抑制伤害性刺激引起的后角神经元的反应，脊髓蛛网膜下腔注射GABAB受体激动剂苯氯丁氨酸(baclofen)可产生长时程的镇痛效应［4］。
阿片受体至少包括3种亚型：μ、δ和κ。其中μ受体(mu-opioid receptor;MOR)和吗啡的镇痛作用密切相关［5,6］。放射自显影［7］、原位杂交［8］及免疫组织化学［9］均证实脊髓后角浅层分布有大量MOR。在内源性的阿片类物质中，甲硫氨酸脑啡肽(M-ENK)与克隆的MOR亲和力最强［10］。M-ENK在脊髓内主要分布于后角浅层，且部分M-ENK阳性神经元同时含有GABA［11］，提示后角浅层内GABA能终末可能与MOR阳性神经元之间存在直接的突触联系。因此，本实验在对猫脊髓后角浅层内MOR免疫阳性成分电镜观察的基础上［12］，对MOR阳性成分与GABA能终末之间的突触联系进行了探讨，旨在为研究GABA与MOR在吗啡镇痛中相互关系提供线索。
材料和方法
实验共用成年雄猫4只。动物在腹腔注射戊巴比妥钠的深麻状态下，先用500ml生理盐水经心脏冲洗血液，然后用1 000ml含4%多聚甲醛，1%苦味酸和0.5%戊二醛的磷酸缓冲液(0.1mol/L PB,pH7.4)灌注固定。立即取出腰骶段脊髓，并在上述固定液内后固定3h(4℃)，振动切片机切片，厚50μm，切片收集于磷酸盐缓冲液(0.01mol/L PBS，pH7.4)内。按ABC法进行免疫组织化学染色。切片在经PBS漂洗后依次移入：(1)豚鼠抗大鼠MOR的IgG(0.5mg/L)［9］，室温孵育过夜；(2)结合有生物素的羊抗豚鼠IgG(Vector;1∶200)，室温孵育3h；(3)ABC复合物(Vector;1∶200)，室温孵育2h。其中，一抗和二抗用含0.01% Triton X-100,0.2%驴血清和0.03%NaN3的PBS稀释，ABC复合物用含0.01%Triton X-100的PBS稀释。最后切片在含0.05%DAB和0.003%H2O2的0.05%mol/L Tris-HCl缓冲液内呈色20～30min。切片经漂洗后在含1%锇酸的PB内室温下固定1h,梯度酒精及环氧丙烷脱水，Epon812平板包埋、聚合(45℃，24h;58℃,48h)。在解剖镜下取出后角浅层，LKB超薄切片机切片并裱于镍网上，然后进行GABA免疫组织化学染色，将镍网置于含兔抗大鼠GABA血清(1∶1 000)和0.01%Triton X-100的Tris-HCl缓冲液(TBST；pH7.6)液滴上，室温下湿盒内孵育24h。经pH7.6的TBST清洗后，再用pH8.2的TBST清洗，然后置于含结合有胶体金(直径10nm)颗粒的羊抗兔IgG(1∶40， British BioCell International)的液滴上，室温下湿盒内孵育3h。醋酸铀，枸橼酸铅染色，Hitachi100电子显微镜观察，摄片。
对照实验在省略一抗或用正常豚鼠血清或兔血清代替一抗的情况下进行。
结 果
用正常豚鼠血清替代或省略抗MOR抗体的条件下进行的对照实验显示，DAB呈色后的切片上只见有浅淡的背底，电镜下未观察到免疫反应阳性产物。包埋后GABA胶体金染色的对照实验亦在同样的条件(省略一抗或用正常兔血清替代)下进行，仅见到[1] [2] 下一页
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