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雷公藤内酯醇诱导人淋巴细胞凋亡的作用与细胞周期的关系 |
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rested activated T cell cycle pregression in S phase and failed to prevent the apoptotic cell death.Conclusion:Triptolide-induced apoptosis of activated T cells is cell cycle dependent,and this may be one of the mechanisms of triptolide for the immune system.
Key words Triptolide Apoptosis Cell cycle
凋亡是独具细胞形态和变化并有重要生物学意义的细胞死亡方式。作者以往的研究已证实，雷公藤内酯醇只能造成已活化的淋巴细胞发生细胞凋亡［1］。作者假设雷公藤内酯醇诱导淋巴细胞发生凋亡的作用可能与细胞的周期相关。因此，本文应用流式细胞术以及DNA凝胶电泳和DNA片段测定等方法，观察雷公藤内酯醇促使活化的淋巴细胞凋亡的作用与细胞周期的关系，以进一步了解雷公藤内酯醇的作用机理。
1 材料与方法
1.1 试剂 雷公藤内酯醇纯品由中国医学科学院皮肤病研究所提供。样品经高效液相层析分析，归一化法计算，其纯度大于99%。雷公藤内酯醇于实验前以DMSO新鲜配制，微孔滤膜(0.22 μm)除菌待用。RPMI 1640(GIBCO)培养液中，含10%灭活小牛血清(四季青生物工程技术研究所，杭州)，L-谷酰胺(2 mmol/L)，2-巯基乙醇(10 mmol/L)，HEPES及青、链霉素各100 U/ml。人类重组白介素-2(rhIL-2)购自南京军区医学研究所，植物血凝素A(PHA-P)和佛波脂(PMA)均购自Sigma公司(美国)。
1.2 人外周血T细胞 淋巴细胞分离液制备健康成人外周肝素抗凝血中的淋巴细胞，再以T细胞分离剂(LK05TD，One Lambda Inc.，美国)分离其中的T细胞，经流式细胞仪检测T细胞纯度＞95%。以含10%灭活小牛血清的RPMI1640配成T细胞悬液(1×106 ml-1)。将PHA-P(5 μg/ml)和PMA (2 ng/ml)加入上述的T细胞悬液中，37℃、5%CO2培养48 h，换液并改加含rhIL-2(50 U/ml)和PHA-P(5 μg/ml)的RPMI 1640(10%FCS)培养液，细胞浓度为5×105 ml-1，继续培养48～72 h后用于实验。
1.3 流式细胞术 参考文献［2］，取待检测细胞(1×106 ml-1)，加入1.5 ml低渗溴化丙啶染液(PI 50 μg/ml溶于0.1%枸椽酸钠和0.1%TritonX-100溶液中)于15×75多聚乙烯管中，4℃避光过夜后，进行流式细胞术(Epics XL型流式细胞仪，Coulter Co.，USA)分析，按100 cells/s计数104个细胞，根据二倍体及亚二倍体峰分析细胞周期和细胞凋亡。
1.4 DNA片段的测定和DNA凝胶电泳 参考文献［3］方法，提取细胞内DNA，分别采用二苯胺测定和凝胶电泳方法，观察所提取的细胞内总DNA片段和电泳区带的变化。
1.5 T细胞增殖的测定 参考文献［4］方法，以3H-TdR掺入率表示细胞的增殖反应。
1.6 统计学处理 以均数±标准差表示实验结果，t检验分析各组间的差异，P＜0.05为统计学差异显著。线性回归方法分析雷公藤内酯醇诱导活化T细胞凋亡的作用与细胞周期的关系［5］。
2 结果
2.1 有丝分裂原刺激下T细胞增殖与细胞周期的关系 如表1所示，98%的新鲜T细胞处于G0/G1期(见图1A)，随着PHA-P浓度的增加，G0/G1期的T细胞数逐渐减少，S期T细胞数增多。10 μg/ml的PHA-P作用48 h后，约有31%～35%的细胞处于S期，5%～7%左右的细胞进入G2/M期(见图1B)。同时，其3H-TdR的掺入量也随PHA-P浓度的升高而增加，与细胞周期中S期细胞数量的变化相一致。
由表2可知，有丝分裂原作用12 h后，只有不足3%的T细胞进入S期。随着有丝分裂原与T细胞作用时间的延长，S期细胞数逐渐增多，同时3H-TdR掺入率也相应增加。
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