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p21Cip1基因对V79 |
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kb; pXJ41-CycD3 (antisense)-T7-1.96kb; pSK-Id-T7-0.93kb; pXJ41-CycB1(antisense)-T7-1.45kb。如果需要，每张膜均做β-actin内参照，每次杂交结果均用密度扫描校正。
5.免疫印迹
取对数生长的细胞(一大方瓶)，加入200μl 85℃ 1×SDS上样缓冲液裂解细胞。裂解液在水浴中煮沸10min，10 000g，离心10min，取上清。Lowry法定量，每孔上样100μg，10%SDS-PAGE电泳，石墨电极半干转移至硝酸纤维素膜上，一抗为兔抗人p21 IgG(本室制备)，二抗为碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG(Promega)，结果用同样的上样量电泳后考马斯亮蓝R-250染色为内参照经密度扫描校正。
6.生长曲线测定(MTT法)
培养于24孔板的细胞，0.5ml培养液中加50μl MTT(5g/L,溶于PBS)，37℃孵育3h，加0.5ml DTW脱色液(1份Triton X-100溶于3份DMF中，摇匀后加入2份去离子水，加枸橼酸至0.2mol/L，pH5～6)，空白对照以0.5ml培养基代替，于570nm处读取OD值［3］，每隔12h测量1个点，每个点为3次测量的平均值。
7.流式细胞光度术(FCM)
细胞用胰酶消化后，离心收集，用冰冷的PBS洗，然后在80%乙醇-20℃固定。12h后，样品用冰冷的PBS洗3次，加入200mg/L无DNase的RNase，37℃保温30min，之后加入1g/L的碘化丙啶(propidium iodide, Sigma)，37℃保温30min，样品在4℃避光保存，并在24h内测量［4］，每种样品做3个平行组。
8.［3H］胸腺嘧啶核苷参入及放射自显影
取对数生长的细胞，加入4mCi/L［3H］胸腺嘧啶核苷(上海核子所)脉冲标记20min，细胞用甲醇：冰醋酸(9∶1)固定，核-4乳胶(中国科学院原子能所)涂片，4℃曝光6d，ID196显影液19℃显影4min，20℃酸性坚膜定影液定影15min，流水冲洗30min，晾干，Giemsa染色，镜检，核内有5个以上银颗粒计为阳性［1］。
结 果
1.p21Cip1在V79-8细胞中存在与人和小鼠不同的两个转录本
Northern杂交的结果表明，V79-8细胞中p21存在两个转录本，除了与人和小鼠相似的约2.1kb的转录本外，还存在1个1.6kb左右的转录本(图1)［5］。
2.建立高表达人p21的细胞株V79-8-SC
重组质粒pXJSC经载体HCMV启动子在体内转录p21的转录本大小应为1.7kb左右，略大于V79-8本身的第2个转录本。
Northern杂交检测转染细胞中p21mRNA的表达情况，转染pXJSC的第3个克隆(图2d)与前两个克隆及转染V79-8-neo的对照组(图2b,c,a)相比，前者明显存在略大于1.6kb的p21 mRNA的表达。密度扫描比较杂交结果的第2条带与第1条带的相对值，对照组V79-8-neo及转染pXJSC的前两个克隆中两者比值约为0.59～0.67，而第3个克隆的比值为1.03，说明pXJSC可在该细胞克隆中有效表达人p21，因此确定为阳性细胞株V79-8-SC。
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