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RB基因在小鼠生殖细胞发生过程中的表达研究 |
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王晓燕** 谭德勇 昝瑞光
(云南大学生物学系，昆明 650091；**云南教育学院生物学系，昆明)
摘 要 为研究RB基因在小鼠生殖细胞发生过程中的表达，用地高辛(DIG)标记的RB基因的DNA探针和碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，在组织切片上进行DNA-mRNA分子原位杂交分析方法，检测了昆明种正常雄性小鼠及雌性小鼠不同发育期生殖细胞发生过程中RB基因的转录表达(mRNA)，结果发现：(1)在睾丸组织中，RB基因只在性未成熟组睾丸曲细精管的初级精母细胞，精子细胞层以及性成熟组睾丸曲细精管的精子细胞层中有强转录表达；在精原细胞和生精干细胞层以及成熟精子细胞中都不表达；(2)成熟卵巢中，RB基因在次级卵泡的卵母细胞中，以及孕期卵巢的次级卵泡的卵母细胞核中均有强度不同的转录表达；初级卵泡的卵母细胞中没有表达，成熟卵泡中的卵母细胞中也不再有表达。这些结果表明，RB基因在小鼠精子和卵子的发生过程中有着重要作用。
关键词 RB基因 基因表达 精子发生 卵子发生 小鼠
RB基因于70年代最先在成视网膜细胞瘤(retinoblastoma)中被发现，并于1980年由Friend等［1］克隆出其所在的DNA片段。RB基因是目前人们较普遍接受并作了较深入、广泛研究的抑癌基因之一。现有研究表明，RB基因是细胞周期控制及细胞分化中重要的调控因子［2］。动物的个体发育的实质，是一个从单个细胞受精卵开始，其基因组中的整套基因如何按一定的表达程序而表达，最后形成一个完整的有机体，在生殖细胞的发生中，基因如何按一定的时空表达程序表达，从而最后形成成熟的精子或卵子，为下一世代的个体发育作准备的问题。因而，生殖细胞是动物个体发育的基础，也是动物两个世代之间的桥梁。作为与细胞生长、增殖分化密切相关的抑癌基因——RB基因，在上述生殖细胞发育过程中基因的表达情况如何呢?探讨这样的问题，将有助于揭示个体发育中基因表达在时空上的特异性，从而揭示发育奥秘，而且也有助于加深和推进对RB基因在动物个体正常发育中的作用的认识。本研究采用组织原位杂交技术，探讨了RB基因在小鼠生殖细胞发生过程中转录表达的空间分布。
材料和方法
1.材料
1.1 睾丸和卵巢：均取自昆明种小白鼠。睾丸分两组取材，每组取5只，未成熟组为5周龄鼠，体重12～15g；成熟组为10周龄以上鼠，体重40～45g，卵巢也分两组取材，同样每组各取5只，成熟组为10周龄以上鼠，体重35～40g；怀孕组为怀孕1周的孕鼠，体重45～50g。
1.2 重组质粒：RB基因重组质粒p4.7R由美国Dryja教授赠送，载体为质粒PBR322中3.1kb的一片段，含有抗氨苄氰霉素基因和复制起点ori C序列；插入子为RB基因全长4.7kb的cDNA，经EcoRI酶切后可得3.8kb和0.9kb两个插入子片段。阴性对照质粒PBR322，全长4.3kb，购自北京东方试剂公司。
1.3 主要试剂：地高辛(DIG)标记、检测试剂盒为德国BM公司产品。
其他试剂和药品均为国产AR级或进口分装。
2.方法
2.1 组织切片：将小鼠以颈椎脱臼法处死，迅速开腹，分别取下睾丸和卵巢，投入10%中性福尔马林中固定过夜，常规石蜡切片，厚10μm，常规贴片，室温干燥备用。
2.2 质粒转化、扩增、抽提按文献［3］：RB基因重组质粒经“氯化钙法”转化，氨苄(Amp)筛选，常规扩增，“碱裂解法”抽提，“氯化钾、聚乙二醇法”纯化，电泳鉴定后，-20℃贮存备用。
2.3 探针制备：
2.3.1 酶切：取质粒p4.7R和PBR322DNA各6μg，分别按0.2IU/μg DNA加入限制性内切酶EcoRI及缓冲液，再用消毒三蒸水调总体积达到80μl，37℃恒温过夜，得到的直链DNA，各取1μg与定量的标准DNA一起电泳，用EB(溴化乙锭)染色，根据其荧光强度来估计各自的DNA含量。
2.3.2 标记：取上述酶切DNA(带基因插入子)1μg，按地高辛标记检测试剂盒使用说明书进行标记：煮沸变性10min，取出速置冰浴中3min，然后顺序加入：混合6聚寡核苷酸引物2μg(Hexamicleo tide maxture)，含4种脱氧核苷三磷酸和DIG标记的dUTP混合物，2μl klenow聚合酶1 u[1] [2] 下一页
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