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人酪氨酸羟化酶基因在猴骨骼肌直接注射后的表达 |
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王 珏 赵 澎 郑少鹏 赵春礼
王 珂 刘玉军 田竟生 徐群渊
(首都医科大学神经科学研究所，北京 100054)
摘 要 为了对多途径治疗帕金森病(PD)提供研究依据，将带人酪氨酸羟化酶基因的质粒pRcTH与脂质体混合后直接注射至猴骨骼肌内，100d后取注射部位肌肉组织，以地高辛标记的hTHRNA探针进行Northern杂交，以检测该质粒在非人灵长类活体骨骼肌组织中表达的目的基因的mRNA水平。本研究结果表明，人酪氨酸羟化酶基因在猴体内有较高效率的表达。本研究提示，质粒可作为基因治疗的较理想的表达载体，而骨骼肌细胞则是一种能携带并表达外源基因的良好靶细胞。
关键词 肌细胞 基因导入 基因表达 人酪氨酸羟化酶基因 非人灵长类
近年来所进行的基因治疗研究是将某种遗传物质转入相应的细胞或组织中，以达到治疗目的。因此，进行基因治疗的关键是基因导入［1］。目前基因导入方法主要有两类：一类是间接法，即从体内取出靶细胞在体外转染遗传物质后再植入体内［2］；另一类是直接法，即把遗传物质直接注入作用部位［1］。目前我们从事的帕金森病(Parkinson disease,PD)基因治疗的研究是以间接法为主，即将多巴胺合成限速酶——酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的基因克隆于质粒或逆转录病毒表达载体以后转染靶细胞(如骨骼肌细胞)，再移植至大脑纹状体［3，4］。对此，有人进行了采用直接注射法的探索性研究［5］，但对其实用性尚有争议［1］，如注射后表达产物的作用范围是否足够大，是否会经轴突到达非病变区等。由于研究显示骨骼肌细胞在长期存活方面优于成纤维细胞［4］，是较为理想的靶细胞；其在携带外源性目的基因——TH基因方向的能力，也已被大量实验所证实。因此，本实验拟将携带人TH基因的质粒pRcTH直接注射至猴骨骼肌中并观察其表达情况，以期为多途径治疗PD提供研究基础。
材料和方法
1.实验动物
本研究使用成年恒河猴1只，雌性，5.37kg(购自中国医学科学院动物养殖场)，60%水合氯醛麻醉，手术暴露左小腿三头肌，直视下注入带人TH基因的质粒pRcTH(由美国Somatix Therapy公司惠赠)20μg与脂质体(lipofectin)(GIBCO)20μg的混合物，注射100d后在麻醉下取注射部位肌肉组织约3g。
2.总RNA提取
用异硫氢酸胍法［6］提取猴肌肉组织总RNA，同时提取引产胎儿(孕6月)肾上腺组织的总RNA作为阳性对照。
3.探针制备
将带有人TH基因的质粒pRcTH(约6.5kb)用限制性内切酶BamHI(华美公司)消化1h(每μg DNA加1IU内切酶，以下同)，得到4.3kb、1.97kb和0.27kb3个片段。用DNA快速纯化回收试剂盒(天象人公司)纯化回收其中的4.3kb片段。再用HindⅢ(华美公司)进行消化，得到2.5kb和1.8kb 2个片段。同样纯化回收1.8kb片段。质粒pGEM3zf(华美公司)(约3.2kb)用BamHI和HindⅢ同时消化，得到3.17kb和0.03kb2个片段，纯化回收3.17kb片段。将来自pRcTH的1.8kb片段与来自pGEM3zf的3.17kb片段混合，加入T4连接酶(Promega)和ATP在12℃下过夜(图1)。取上述混合物5μl与感受态大肠杆菌(DH5α)混合经冰浴45min、42℃45s、再冰浴2min后，加SOC 800μl,37℃振摇1h(120r/min),取出50μl铺板(Amp+)。筛选鉴定正确插入的克隆pGEMTH。
将新重组的质粒pGEMTH用XhoI完全消化，使之线性化，作为合成探针的模板。用DIG RNA标记盒(Boehringer Mannheim公司)中T7 RNA聚合酶合成地高辛标记的RNA探针(约1.4kb)。标记后与试剂盒中的标准标记RNA(1g/L)同时直接显色，检测hTH RNA探针的浓度及灵敏度。
4.Northern Blot
取猴肌及人胎肾上腺的总RNA各3μl，进行含甲醛凝胶电泳，用真空印迹仪将RNA转运至尼龙膜上，120℃下干烤30min。加杂交液(50%甲酰胺，5×SSC，2%阻滞试剂，0.1%十二烷基肌氨酸，0.02%SDS 20ml/100cm2)，68℃下1h。再加入含RNA探针100ng的杂交液([1] [2] 下一页
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