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运用AFLP技术筛选分离野败型水稻mtDNA中与雄性不育性状相关的片段 |
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退火温度高, 因而假阳性低, 重复性好, 克服了RAPD的缺点。本文以野败型水稻为材料, 以AFLP为手段比较崐了不育系与保持系及F1杂种 mtDNA 的差异，并对有关片段的转录情况进行了分析。
1 材料与方法
1.1 材料
野败型不育系(珍汕97A)、保持系(珍汕97B)以及F1杂种(汕优63)暗室培养10天的黄化苗。
1.2 线粒体DNA和总RNA的提取
黄化苗材料按10 ml/g加入匀浆液A(0.4 mol/L甘露醇、1 mmol/L EDTANa2，5 mmol/L KCl, 0.1% BSA, 50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 2 mmol/L β巯基乙醇), 匀浆过滤; 滤液3 500rpm, 4℃离心10 min; 上清8 500 rpm，4℃离心15 min。沉淀溶解于匀浆液B(无β-巯基乙醇的匀浆液A)。3 500rpm，4 ℃离心10 min; 上清12 000rpm，4℃离心25 min，沉淀即为粗线粒体。
粗线粒体梯度离心前先加过量DNaseI 以除去核DNA及破碎线粒体DNA。蔗糖梯度为60%、50%、36%和20%，SW41水平转头30 000 rpm，4℃离心50 min。收集 36%～50%界面部分，溶于4倍体积匀浆液B。10 000 rpm，4℃离心10 min，沉淀即为纯化的完整线粒体。
纯化线粒体经10% SDS和裂解液(10 mmol/L EDTANa2，50 mmol/L Tris-HCl，pH7.5)裂解, RNase 消化RNA后，常规酚.氯仿抽提以分离纯化mtDNA。纯化线粒体用于总RNA提取。Promega公司总RNA提取试剂盒提取, 具体操作按试剂盒说明书要求。
1.3 AFLP反应
AFLP各步反应基本参照 Maheswaran等的方法〔8〕，但接头和引物序列略有不同，选择引物只含一个选择碱基。
PstI接头:
AGCATGCGTCATGCA MseI接头: AGCATGCTCCTGAG
ATCGTACGCAGT CGTACGAGGACTCAT
前扩增引物“P”: 5 AGCATGCGTCATGCAG3 ，“M”: 5 GCATGCTCCGAGTAA3 ；选择扩增引物“PN”: 5 AGCATGTCATGCAGN (N: A，T，G，C)，“MN”: 5 GCATGCTCCTGAGTAAN (N:A，T，G，C)。选择扩增产物经5%PAGE变性胶电泳分离，银染，最后用APC膜照相记录实验结果。
1.4 Northern分析
总RNA 5μg用于甲醛变性胶的电泳分离和转膜，Northern分析预杂交液，杂交液成分和洗膜等条件均参照Wise等的方法〔9〕。探针为银染胶回收条带并经PCR扩增的产物。随机引物标记探针。
2 结果与分析
2.1 AFLP分析结果
3种材料的mtDNA在同样条件下酶切、连接、前扩增和选择扩增, 选择产物经5% PAGE变性胶电泳并银染。结果显示, 引物对M/PN (N: A, T, G, C)只含一个选择碱基时扩增效果较好, 产物有20条带左右，比较3种材料的扩增产物带型发现不育系和F1杂种几乎完全一致，未发现有差异；而不育系与保持系间存在差异。如图1所示，引物对M/PA选择扩增产物条带ZA1、ZA2和ZA3不育系与F1杂种之间完全一致，而保持系却无或弱。另外，条带ZA3很强，条带ZA1、ZA2则弱，这种差异是各酶切片段扩增产物量不同引起的，也说明不同片段在mtDNA 中拷贝数不同。条带ZA3强表明该片段线粒体基因组中的拷贝数可能不只一个。
图1 AFLP分析结果A.不育系；B.保持系;F1.杂种1代；ZA1、ZA2、ZA3.不育系和F1特异带。
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