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HPV16E6E7转导的卵巢癌细胞系顺铂耐药性的变化 |
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resistant changes were not found in HPV16E6E7 transformed ovarian cells.The above study lay a foundation for the establishment of immortal ovarian carcinoma cell lines by means of HPV16E6E7 transduction,especially the drug-resistant ovarian ones.
【Key words】 Ovarian neoplasms/drug-resistance; Human Papillomavirus
卵巢癌已成为妇科肿瘤第一位的死亡原因。常规治疗包括手术、化疗、放疗。尽管手术范围不断扩大，新的化疗药物不断涌现，但是其5年存活率并未因此而明显提高，其原因之一在于卵巢癌的耐药［1］，所以研究其耐药机理及其生物学行为是卵巢癌防治最迫切的研究课题。然而，由于卵巢癌病理类型复杂，目前尚缺乏齐全的细胞系。卵巢癌细胞体外原代培养又很困难，因而限制了对其进一步的研究。人乳头瘤病毒16型E6E7(HPV16E6E7)区基因编码的蛋白具有转化能力，可以使人的上皮细胞永生化［2］，因而，利用HPV16E6E7转导卵巢癌原代细胞，建立卵巢癌永生细胞系(包括耐药的细胞系)，或许会对卵巢癌耐药研究提供理想的模型。但是用HPV16E6E7转导卵巢癌细胞建立的细胞系是否会发生耐药性的改变，又成为人们关注的问题。
材料和方法
1. 含有HPV16E6E7重组逆转录病毒载体pLXSN16E6E7
由美国华盛顿大学Galloway D A教授惠赠。采用EcoRI、BamHI进行酶切鉴定。其结构模式图如下：
2. 逆转录病毒的包装及滴度测定
pLXSN16E6E7以及pLXSN空载体采用脂质体方法(保灵曼公司DOTAP)，转染逆转录病毒包装细胞PT67(CLONTECH RetroPackTMPT67)。具体步骤如下：(1)转染前20h传代PT67，使转染时细胞密度达到30%～40%汇合，(2)准备DOTAP/DAP混合物(以25ml的培养瓶的转染为例)：25μg的质粒DNA(按质粒的大量制备［3］的方法制备)以20mmol/L,pH7.4Hepes缓冲液稀释至25μl，DOTAP15μl以上述同样的Hepes缓冲液稀释至50μl，两者混合，室温孵育1h，(3)将PT67的培养基换以含DOTAP/DNA的新鲜培养基，37℃孵育10h，之后换为完全培养基，(4)48h后，开始G418筛选。大约2周后出现抗性克隆，采用滤纸法消化转移单克隆［4］，扩大培养，至产病毒细胞株80%融合时，换液收集24h的病毒液。病毒滴度的测定采用生物学方法［5］，经测定筛选出1株产pLXSN16E6E7病毒滴度达1.9×107/ml的产病毒细胞株，和1株滴度达5.6×106产pLXSN病毒株。
3. 卵巢癌细胞系的转导［4］
SKOV3、3AO均系卵巢上皮癌细胞系。SKOV3来自美国模式培养物保藏所(ATCC)，3AO来自中国科学院上海细胞库，由本室冻存、传代培养。传代24h后，使细胞达到30%～40%汇合，将收集的24h病毒上清，加Polybrene(Sigma)至8mg/L,0.45μm微型滤器过滤，加入上述细胞中，感染24h后，换为完全PRML 1640，再过48h，1∶5传代入G418筛选培养基中，G418浓度为600mg/L，每4～5d换液1次，至2周左右出现克隆，仍采用滤纸消化法转移克隆，此时G418降为300mg/L维持，扩大培养。
4. 转导的卵巢癌细胞系HPV16E6E7表达检测
采用RT-PCR和免疫细胞化学方法，各筛选出1株HPV16E6E7稳定表达克隆。
4.1 RT-PCR:采用GIBCO公司的TRIZOL试剂提取SKOV3/E6E7,SKOV3/pLXSN,SKOV3;3AO/E6E7，3AO/pLXSN,3AO细胞的总RNA，取2μg总RNA，采用随机引物法进行反转录，然后进行HPV16E6E7的聚合链酶反应。HPV16E6E7的引物由SyberSyn公司合成。
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