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未成熟树突细胞诱导同种免疫低应答性的研究 |
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e in MLR in vitro.
Key words Dendritic cell Allo-hypo-immuno -responsiveness Mixed lymphocyte reaction
树突细胞(dendritic cell,DC)是功能很强的专职抗原递呈细胞(antigen presenting cell, APC)［1］。成熟DC表面表达丰富的MHC分子和辅助刺激分子，能有效地递呈抗原并激 活T细胞发生免疫应答。而在骨髓细胞分化到成熟DC过程中的某一阶段，细胞表面呈现高 表达的MHC分子，而只低表达辅助刺激分子。这种未成熟DC缺乏启动T细胞应答的功能［ 2］。已知T细胞的活化需要接受两个以上的信号刺激，单独通过TCR对MHC复合体/抗原肽 的识别通常不能引起T细胞充分活化，反而诱导出免疫耐受或低应答状态［3］。利用 未成熟DC缺乏辅助刺激分子这一特点，有可能在体外诱导出同种低应答反 应，并可能作为同 种移植耐受的耐受原，在延长移植物存活时间中起作用。本文利用骨髓内皮细胞作为 饲养细胞在体外扩增骨髓细胞后，经GM-CSF 诱导培养得到大量 未成熟DC，在体外初次和再次MLR系统中诱导同种异品系T细胞产生免疫应答反应。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 用干粉按常规分别配制成10%FCS-PRMI1640完全培养液 ， 20%FCS-DMEM完全培养液和20%FCS-IMDM完全培养液；抗CD86-FITC和抗CD80-FITC(Pharm ingen公司产品)。抗H-2Kd-PE和抗H-2-I-Ab-FITC(beckon-dickson公司产品)。 DEC205单克隆抗体，取自DEC205杂交瘤细胞培养上清液。抗大鼠Ig-FITC(Pharmingen公司 产品)，GM-CSF(R&D公司产品)。
1.2 细胞株 BMEC小鼠骨髓微血管内皮细胞，来源于C57BL/6(H-2d)， 由上海市胸科医院，胸部肿瘤研究所董强刚博士惠赠。DEC205杂交瘤细胞由美国University of Pittsburgh,Prof Lina Lu惠赠。
1.3 动物 C57BL/6(H-2b)，Balb/c(H-2d)，AKR(H-2k)小鼠， 均为6～8周龄，18～20 g，清洁级，均购自中国科学院上海实验动物中心。
1.4 树突细胞的培养
1.4.1 骨髓细胞的扩增 按文献［4］报道方法。
1.4.2 DC的培养 取已扩增的骨髓细胞，重悬于10%FCS-1640完全培养 液中，2×106细胞/孔置于24孔板中，加细胞因子GM-CSF 4 ng/ml，37℃，5%CO2，培 养2 d。吸去75%培养液和非粘附细胞，重新补足培养液及细胞因子GM-CSF 4 ng/ml，37℃ ， 5%CO2，继续培养3 d，收集低粘附细胞，即为未成熟DC。同样条件下增加GM-CSF含量(10 ng/ml)并在交换培养液时添加TNF-α 200 U/ml，37℃，5%CO2，继续培养3 d。收集悬 浮细胞，可收集到成熟的DC［5］。
1.5 树突细胞的鉴定 光镜观察形态变化和FACS检测其表面标记。
1.6 初次MLR 无菌条件下置备BALB/c鼠脾脏细胞悬液，经尼龙毛柱［6］纯化得到的T淋巴细胞作为应答细胞。经Thy-1抗体用CDC法检测T细胞纯度为89 % 。刺激细胞分别为C57BL/6不成熟DC、成熟的DC和C57BL/6的脾脏细胞以Balb/c的脾脏细胞为 阴 性对照，均经丝裂霉素灭活。在表1中分别以imDCm,mDCm,C57m,Balb/cm代表刺激细胞 与应答细胞的比例为1∶1，1∶10，1∶100加入9 6孔圆底培养板各孔。应答细胞为2×105/孔，刺激细胞分别为2×105/孔，2×104/孔 ，2×103/孔，总体积为200 μl/孔，均设3复孔置37℃5%CO2混合培养3 d或5 d，终止 反应前18 h加入3 H-TdR 0.5 μCi/孔，培养结束时用多头细胞收集仪将细胞收集于 纤 维滤纸上，β液闪仪测定cpm值，反应强度以SI表示。刺激指数(SI)按公式SI=实验组cpm值/(灭活刺激细胞的cpm+应答细胞的cpm)计算。
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