雷公藤内酯醇抑制胰腺癌细胞增殖和诱导凋亡的研究

　　1.2 方法

　　1.2.1 TL药液配制及给药处理

　　TL粉剂1 mg，DMSO 100 μl助溶，磷酸缓冲液(PBS)按10倍稀释，配成药物原液，室温保存。应用时加DMEM培养基稀释成所要求的药液浓度。

　　1.2.2 TL对细胞毒性作用的形态学观察

　　药液浓度10-1 μg/ml的TL孵育SW1990细胞，倒置显微镜分别观察24、48、72 h的细胞形态变化。

　　1.2.3 TL对细胞生长的抑制作用

　　指数生长期的SW1990细胞以4×103个/孔传入96孔培养板，孵育24 h后，每孔加入不同药液浓度(101～10-5 μg/ml)的TL 100 μl，所含溶媒DMSO最高终体积分数为0.1% (该浓度对细胞无明显损害)，对照组加入等量培养基和溶媒DMSO(0.1%)。分别于加药后24、48、72 h检测细胞活力。细胞孵育终止前，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，4 h后弃上清液，用100 μl 0.4 mmol/L酸化异丙醇溶解结晶，用酶标仪测定每孔的A值，以A值代表细胞生长的程度(A=λ570)，计算各种药物浓度和不同时间的TL对细胞的抑制率。

　　1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡细胞和细胞周期的改变

　　收集的细胞(TL 10-1 μg/ml孵育24 h的细胞和对照组)用70%预冷的酒精固定，置于-20 ℃条件下过夜。细胞悬液再用0.01 mmol/L PBS洗2次，调整细胞浓度为1×107个/ml，取200 μl细胞，加入RNA酶(0.1%)100 μl，37 ℃孵育30 min，加入PI染液至终浓度为50 μg/ml。用尼龙网过滤后20 min后上流式细胞仪检测。AnnexinⅤ/PI双染法检测凋亡细胞程度。 根据公式计算细胞增殖指数(PI)。细胞增殖指数(PI/%)=( S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

　　2 结 果

　　2.1 TL对胰腺癌细胞形态的影响

　　胰腺癌细胞SW1990经TL作用后发生明显形态改变，随着时间推移，变化越明显。10-1 μg/ml药液浓度的TL与SW1990细胞孵育:24 h后细胞生长较密，且多数细胞形态饱满，少部分细胞变圆、变小，少许细胞脱落;48 h后细胞生长较稀疏，细胞形态变小，脱落细胞明显增多;72 h后大多数细胞脱落、漂浮。

　　2.2 TL对胰腺癌细胞增殖的影响

　　取不同浓度TL对SW1990细胞进行增殖抑制试验寻找最佳给药浓度，培养6、12、24 h后，TL均对SW1990细胞表现出抑制作用，起效质量浓度分别为1 μg/ml、10-1 μg/ml和10-2 μg/ml(P<0.01)。且随着药物质量浓度的提高，对SW1990细胞增殖抑制作用相应增加，1 μg/ml、10-1 μg/ml和10-2 μg/ml各药物浓度组比较差异不明显(P>0.05)。我们选择10-1 μg/ml作为半有效量(ID50)作为实验用量。

　　2.3 TL对胰腺癌细胞凋亡和细胞周期的影响

　　随着TL药液浓度的增高，SW1990细胞凋亡指数增高，以10-1 μg/ml TL作用于SW1990胰腺癌细胞，观察不同时间(0、6、12、18和24 h)的诱导凋亡效果，与用药组相比较，凋亡的胰腺癌细胞数目明显增多，随着作用时间的延长细胞凋亡率逐渐升高，从6 h始，TL处理组凋亡率显著高于对照组，24 h凋亡率达38.50%，而对照组则仅为14.97%(图1、2，见封二)。TL(10-1 μg/ml)与SW1990细胞孵育24 h后，G0/G1期细胞占(69.57±0.34)%，G2/M期占(9.74±1.22)%，S期细胞为(20.69±1.09)%。对照组细胞， G0/G1期为(45.74±0.82)%， G2/M期为(17.51±5.41)%， S期为(36.80±6.95)%。与对照组相比较，药物干预组G0/G1期细胞显著高于对照组(P<0.01)，而G2/M期细胞和S期细胞低于对照组(P<0.05)(图3、4，见封二)。药物作用组的PI为(29.43±0.33)%，显著低于对照组(54.26±0.89)%(P<0.01)。

　　3 讨 论

　　雷公藤内酯醇，又称雷公藤内酯、雷公藤甲素，是从卫矛科雷公藤属雷公藤、昆明山海棠以及苍山雷公藤、东北雷公藤等物质中分离得到的二萜内酯化合物。TL的生理活性强，具有显著的抗炎、抗肿

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