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一个三姐妹同患P450c 17 缺陷家系的分子遗传学研究 |
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陷主要表现为青春期前出现高血压，低血钾；女性呈性幼稚，原发性闭经；男性表现为假两性畸形〔1，2〕。
从1966年Biglieri等〔3〕报道第1例17α-羟化酶缺陷以来，到目前国外见诸文献的报道已超过130例，国内也见多例报道〔4，5〕，但在中国人中尚无关于该病的分子遗传学研究的报道。我们发现了三姐妹同患P450c 17α缺陷，对3例患者并对其家系成员进行突变位点的等位基因特异性扩增及酶切检测，以明确CYP17基因突变在家系中的传递情况。
对象与方法
一、对象
3例患者及其无相关临床症状的父母亲、同胞兄弟、叔父和祖母以及3例正常个体(为门诊体检者)。3例P450c 17α缺陷患者经临床、生化及激素检测确诊，具有典型的高血压、低血钾、性幼稚和原发性闭经的表现，血皮质醇和去氢异雄酮水平低下，而血ACTH异常升高。家系图见图1。
图1 三姐妹同患P450c 17α(17α-羟化酶/17，20-裂解酶)缺陷家系的系谱图
Fig 1 Pedigree of the family with three sisters suffering from
P450c 17α deficiency (17α-hydroxylase/17,20-lysase)
二、方法
1.DNA提取：取外周血10ml，抗凝，按常规苯酚-氯仿法抽提基因组DNA。
2.筛查基因突变的聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)法：CYP 17基因外显子1的引物为：上游5'-CAACTTACCATTTGAGGCCG-3'，下游5'-TATCTTGCCTGCCGGCACCC-3'；外显子8的引物序列为：上游5'-GCGTTTCTTGAATCCAGCGG-3'，下游5'-CAGGGGCTGTGAGTTACAGC-3'。其余外显子的引物设计见参考文献〔6〕。50μl反应体系中，分别加入上下游引物各10pmol，DNA模板500ng，10×缓冲液5μl，10mmol/L dNTPs 1μl，25mmol/L MgCl2 3μl，Taq酶(Promega公司)1.5U。95℃预变性3分钟后，95℃变性30秒，55～65℃退火40秒，72℃延伸1分钟，35个循环后，再72℃延伸10分钟。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，在8%～10%的聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺为49:1)中进行SSCP分析。PCR产物8μl，加8μl变性上样液，95℃变性10分钟后，立即置于冰上，5分钟后上样。以1×TBE为电泳缓冲液，15～20℃条件下，110V电压电泳15～18小时。电泳结束后取胶用银染法显色。
3.CYP 17基因分子克隆和DNA测序：对有SSCP异常条带的外显子6的PCR产物用QIAquick柱(QIAgen公司)抽提后，直接作为双链模板测序。将CYP 17基因外显子8的PCR产物纯化后，与pGEM载体连接过夜，连接产物转化大肠杆菌TG1感受态细胞，LB培养过夜。以IPTG/X-Gal体系筛选白色菌落，碱裂解法快速抽提质粒，用PstI和ApalI酶切后，电泳鉴定重组质粒。用ABI 377荧光自动测序仪(Perking-Elmer公司)进行DNA序列分析。
4.CYP 17基因外显子6的等位基因特异性扩增：针对测序的结果并根据文献〔6〕，设计下游引物：突变型5'-GGAGTCAACGTTGGCCTTGT-3'，野生型：5'-GGAGTCAACGTTGGCCTTG A-3'，其中划线的碱基与突变碱基互补，并以外显子5的5'引物为上游引物，进行PCR扩增。PCR反应的退火温度为58 ℃，循环圈数为25圈，其他反应条件与前述相似，产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察并拍照。
5.CYP 17基因外显子8的酶切分析：采用Bcl I内切酶进行酶切反应，反应体系中有PCR产物8μl，加入乙酰化牛血清白蛋白0.2μl，Bcl I酶(Promega公司)5U，50℃酶切1～4小时。酶切产物经3%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果并拍照。
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