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强直性脊柱炎患者外周血Th1 Th2淋巴细胞类型 |
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he peripheral blood of the AS patients,that is,there is a shift toward T cells with a Th1 cytokine profile.But Th1 cells seem to secrete fewer cytokines after stimulated by PMA/ionomycin than Th2 cells.
【Key words】 Spondylitis,ankylosing; Th1 cell; Th2 cell; Three-color flow cytometric analysis
目前认为，人类CD4＋T细胞(即T辅助细胞，Th)可根据产生细胞因子类型的不同分为3个亚型：1型(Th1)、2型(Th2)和3型(Th0)细胞。其中Th1细胞分泌白细胞介素-2(IL-2)、干扰素γ(IFNγ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，最近认为白细胞介素-17(IL-17)亦主要由Th1细胞产生；而Th2细胞分泌白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)和白细胞介素-13(IL-13)。Th细胞在许多免疫反应中发挥着各种作用。Th1细胞主要参与细胞免疫，介导迟发型变态反应，并与器官特异性自身免疫性疾病的发病有关；而Th2细胞主要参与体液免疫反应，激发Ⅰ型变态反应，并有一定的阻止某些自身免疫性疾病进展的能力。CD4＋T细胞在慢性自身免疫性炎性疾病中发挥着重要作用，如多发性硬化、糖尿病和类风湿关节炎(RA)等［1］。
强直性脊柱炎(AS)是一种慢性炎性疾病，主要侵犯中轴骨骼，以骶髂关节炎为标志。炎性外周关节炎常为病程中的突出表现。另外一种常见的关节炎性疾病—RA与Th细胞的关系已得到广泛研究，但AS与Th细胞群的关系却未受到普遍关注。鉴于此，本文拟通过检测AS患者外周血中CD4＋和CD8＋T淋巴细胞分泌细胞因子的情况，探讨T淋巴细胞亚群与AS发病的关系。
1 资料与方法
1.1 三色流式细胞分析法检测分泌IFNγ和IL-4的CD4＋、CD8＋细胞
1.1.1 病例选择：14例AS患者为近期收住院病人，均符合美国风湿病协会1986年修订的诊断标准。男性6例，女性8例，年龄17～35岁，平均26岁，病程3个月～11年，平均3.3年。对照组为7名健康志愿者。
1.1.2 主要试剂：Cy-chrome标记的抗CD4单抗(鼠抗人IgG1k；RPA-T4克隆)，Cy-chrome标记的抗CD8单抗(鼠抗人IgG1k；RPA-T8克隆)，PE标记的抗IL-4单抗(鼠IgG2a；MP4-25D2克隆)，FITC标记的抗IFNγ单抗(鼠IgG1；4S.B3克隆)，PE标记的鼠IgG1同种型对照免疫球蛋白(R3-34克隆)，FITC标记的鼠IgG1同种型对照免疫球蛋白(MOPC-21克隆)，Cy-chrome标记的鼠IgG1，κ同种型对照免疫球蛋白(MOPC-21克隆)、细胞内染色试剂盒和红细胞裂解液购自Phar Mingen公司。佛波醇乙酯(PMA)和离子霉素(ionomycin)购自Sigma公司。IMDM培养基和胎牛血清购自Gibco Brl公司。
1.1.3 方法：静脉采血1 ml，肝素抗凝。用IMDM培养基按1∶1的体积稀释全血，充分混匀。向稀释血中加入刺激剂PMA(20 ng/ml)、离子霉素(1 μg/ml)和蛋白质转运抑制剂monencin(2 μmol/L)以阻止细胞因子向细胞外分泌。混匀后每200 μl液体分别加入5 ml塑料试管，在37 ℃ 5% CO2环境中孵育4 h。加入2 ml红细胞裂解液，暗环境中孵育10 min，使红细胞充分裂解。离心5 min，500 g，弃上清。以染色缓冲液清洗1次，离心5 min，500 g，弃上清。对细胞表面抗原进行染色，每管加入20 μl Cy-chrome标记的CD4、CD8或对照单抗，常温孵育15 min。用染色缓冲液清洗1次，离心(500 g)，去除上清。用500 μl PBS/4%多聚甲醛溶液重悬浮细胞20 min。以PBS/1%皂素溶液清洗细胞，使细胞膜出现微孔以利于抗细胞因子单抗进入细胞。离心5 min，500 g，弃上清。细胞内细胞因子染色，每管加入0.2 μg FITC-标记的鼠抗人IFNγ单抗和PE标记的鼠抗人IL-4单抗，室温避光30 min，同时以相应的同上一页 [1] [2] [3] 下一页
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