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几种抗氧化剂对细胞间粘附分子 |
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alpha;)刺激的内皮细胞表面ICAM-1表达，并用抗氧化剂PDTC，DCI(3，4-二氯异香豆素),chrysin(5,7-二羟黄酮)及临床广泛使用的抗动脉硬化药probucol(普罗布考)进行实验，目的是探讨抗氧化剂能否调节内皮细胞表面的粘附分子表达以及这种调节是否有NF-κB的参与。
方 法
一、人脐静脉内皮细胞培养
新生儿脐带取自Virchow医院妇产科。分娩后30 min内从胎盘剪下脐带，用脐带夹夹闭两端，放入盛有磷酸缓冲液(PBS)的无菌容器中。置4℃冷藏，内皮细胞于24 h内分离。检查脐带。切去所有有夹痕的部分。将直径1.0 mm穿刺针套管插入脐静脉，并把脐带固定。用PBS冲洗掉残余血，然后加10 mL胶原酶(2.4 U/mL)入脐静脉。37℃，30 min孵浴，然后收集脐静脉内的细胞悬液，以200 g、5 min离心沉淀。移去上清后，将细胞培养在37℃二氧化碳培养箱中。内皮细胞培养液用M199加入20%胎牛血清，100 μg/mL青霉素，100 μg/mL链霉素，10 ng/mL内皮细胞生长因子，和2 mmol/L L-谷氨酸配制而成。T 75组织培养瓶瓶底用以2%明胶包被。
二、受试抗氧化剂
PDTC(Pyrrolidine-dithiocarbamate, C5H9NS2NH3，Sigma),DCI (3,4-dichloroisocoumarin, C9H4Cl2O2，Sigma),Chrysin(5,7-dihydroxyflavone, C15H10O4，Sigma), Probucol(C31H48O2S2，Sigma)，各种药物受试浓度梯度为：10-7，3×10-6，10-6，3×10-5，10-5，3×10-4，10-4mol/L。
三、细胞ELISA方法
将传了两代的HUVEC种到经明胶包被的96孔组织培养板上。待细胞融合后先用抗氧化药孵15 min，然后加TNFα(500 U/mL)刺激5 h。每次实验都设未经TNFα刺激的内皮细胞为阴性对照。5 h后用磷酸缓冲液冲洗内皮细胞，加入抗ICAM-1的单克隆抗体于37℃孵浴30 min。再用PBS冲洗2次后加入碱性磷酸酶标记的抗鼠抗体于37℃孵浴30 min。用磷酸缓冲液3次后加入100 μL p-磷酸硝基苯。45 min后在ELISA读数仪上测定吸收率。
四、凝胶电泳迁移率分析(EMSA)
融合的HUVEC加抗氧化剂(浓度皆为50 μmol/L)预处理15 min后，加TNFα(500 U/mL)刺激1 h。以仅加TNFα、未经抗氧化剂预处理的样本为阳性对照，只含内皮细胞培养液的样本为阴性对照。按Dignam方法制备核提取物［3］。然后取10 ng与放射性(γ32P-)ATP标记的NF-κB寡核苷酸片段反应。结合反应在10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5), 50 mmol/L NaCl, 0.5 mmol/L DTT, 5 mmol/L EDTA, 0.25 mmol/L MgCl2， 3 μmol/L poly (dI-dC), 4%甘油中进行。DNA-蛋白质复合物在4%不饱和聚丙烯酰胺凝胶中，160 V、4℃电泳2 h。然后让凝胶干燥，放射自显影。
五、统计处理
计数资料以平均数±标准差表示，统计学意义用方差分析和t检验处理。最大半抑制浓度用非线性回归计算得出。
结 果
一、内皮细胞表面ICAM-1表达
内皮细胞表面粘附分子ICAM-1的表达经细胞ELISA方法定量分析。在未经TNFα刺激的细胞，ICAM-1有低水平的表达(OD值0.45±0.07对照本底0.15±0.04，P＜0.01)。用TNFα刺激人脐带静脉内皮细胞5 h后这种粘附分子的表达明显增强，是基础水平的2.6倍。
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