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上海地区 型丙型肝炎病毒包膜区cDNA序列分析 |
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丙型肝炎病毒(HCV)是输血后及散发性非甲非乙型肝炎的主要病原。HCV为长约9.4 kb的单股正链RNA病毒，其中E1、E2区是HCV基因组中变异最大的部位，其编码的包膜糖蛋白可能刺激机体产生保护性抗体［1，2］。E2包膜区内的高变区(HVR1)是产生中和抗体的关键部位，但对免疫逃避株无中和作用［3］。包膜区的高度变异导致病毒准种及免疫逃避株的产生，给疫苗的研制带来困难。
我们对上海地区Ⅱ、Ⅲ型HCV E1、E2/NS1区进行了序列测定，并与国内外分离株作比较，分析其同源性及变异特点。
材料与方法
一、血清标本
2份血清标本来自上海第二医科大学瑞金医院传染病科住院患者，有输血史，丙氨酸转氨酶(ALT)异常，经Abbott试剂检测抗-HCV(+)，上海华美试剂检测HCV RNA(+)。采用Okamoto基因分型法［4］，1份血清为Ⅱ/1b型，另1份血清为Ⅲ/2a型。
二、HCV-E1、E2/NS1片段扩增
用异硫氰酸胍裂解，酚、氯仿提取HCV RNA，逆转录后，经套式-聚合酶链反应(Nested-PCR)扩增得所需片段。PCR及测序引物参考HCV-J［5］、HCV-BK［6］、HCV-HB［7］及HC-J6［8］株序列，选择相对保守的区域设计，由上海市血液学研究所合成。
PCR及测序引物序列及位置如下： E1区Ⅱ型引物
外引物 S1 5′-CTCATGGGGTACATTCCGCT-3′ 397～416
A1 5′-GCG(A)AAGAGTAGCATCACAATC-3′ 1116～1136
内引物 S2 5′-CGGAATTCATGGCACATGGTGTCCGGGTT-3′ 452～471
A2 5′-CGGAATTCATCACAATCAAA(G)ACCTTAGCC-3′ 1104～1125
E1区Ⅲ型引物
外引物 QS1 5′-CCGACCTCATGGGGTACAT-3′ 392～410
QA1 5′-CAAAGAGTCATTGCAGTTCAG-3′ 1279～1299
内引物 QS2 5′-CGGGATCCATGGGGAACTTACCCGGTTGCTC-3′ 499～518
QA2 5′-CGGAATTCCGGTGCGGTTGATGTGCCA-3′ 1258～1276
E2区Ⅱ、Ⅲ型通用引物
外引物 S3n 5′-GGTCACCGCATGG(CG)TTGGGA-3′ 943～962
A3n 5′-CACGTCTTGGTGA(AG)CC(CG)AGTG-3′ 1671～1691
内引物 S4n 5′-CGGGATCCTGGGATATGATGATGAACTGGTC-3′ 958～980
A4n 5′-CGGAATTCCAGCACGTCTGTCTCATTCTCC-3 1590～1611
* 划线部分为酶切位点
三、PCR产物直接序列分析
采用DNA测序试剂盒，根据双脱氧链末端终止法原理，在373A DNA全自动测序仪上测定，测序引物采用PCR扩增时的内引物，同一片段正反两方向测定。
结果
一、PCR扩增产物电泳结果
Ⅱ型HCV株经外引物S1、A1及内引物S2、A2扩增，Ⅲ型HCV株经外引物QS1、QA1及内引物QS2、QA2扩增，得到片段包含全部E1及部分C区片段，Ⅱ型长度为674 bp，Ⅲ型长度为778 bp。Ⅱ型、Ⅲ型HCV经外引物S3n、A3n及内引物S4n、A4n扩增得到长度为654 bp的部分E2区片段。
二、核苷酸序列分析结果
测定了上海株Ⅱ型HCV-SH2、Ⅲ型HCV-SH3的E1区及部分E2区(包括两个高变区)共1 005 bp的核苷酸序列，并与国内外其它分离株进行了比较，其同源性结果列于表1。
表1 上海株Ⅱ、Ⅲ型与其它分离株E1、E2/NS1上一页 [1] [2] [3] 下一页
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