胰岛素分泌与糖尿病 从分子到临床

中华内分泌代谢杂志 1999年第5期第15卷 消息

　　Graves 病(GD)为一常见病，属于自身免疫性疾病，患者血清中存在着抗促甲状腺激素(TSH)受体的自身抗体(TRAb)，它可刺激甲状腺细胞分泌过多的甲状腺激素，致甲状腺机能亢进，但此病的发病机制仍未十分明确。原癌基因在细胞的生长、分化和发育方面起着重要的作用。c-fos是一类核内原癌基因，它可被激素快速而短暂地激活，它也是转录激活因子AP-1的组成成份，它的激活是基因表达中最早的变化之一，这表明c-fos在信号传导中起着关键的作用。因此甲状腺细胞生长与c-fos mRNA表达的内在联系就成为一个新的研究方向。

　　本文就TRAb诱导大鼠甲状腺(FRTL-5)细胞原癌基因c-fos表达与Graves’病甲状腺肿机制进行了研究及探讨。

　　一、材料与方法

　　1.血清IgG的提取：11例经临床确诊甲状腺Ⅱ度肿大的GD患者(其中8例未经治疗)和15例正常对照者血清经Protein A Sepharose CL-4B亲合层析法提纯IgG，冷冻干燥成粉末。

　　2.FRTL-5细胞的培养：参照Hatabu等人的方法，使用含5%小牛血清，3H(1U/L bTSH,1　　mg/L牛胰岛素，5mg/L人转铁蛋白)，3抗(240U/ml青霉素，160U/ml庆大霉素，200mg/L链霉素)的F-12培养液(GIBCO)，在37℃，5%CO2细胞培养箱中培养FRTL-5细胞，每隔3～4天换液。

　　3.刺激cAMP分泌：FRTL-5细胞转移到24孔板培养7天至亚融合状态，换无bTSH的2H培养液继续培养6天，用TRAb刺激后，使用3H-cAMP试剂盒(中国原子能研究所)检测cAMP含量。

　　4.FRTL-5细胞生长的检测：使用3H-胸腺嘧啶核苷(3H-Tdr)掺入细胞DNA的方法。FRTL-5细胞转移到24孔板培养7天至亚融合状态，换无bTSH的2H培养液继续培养6天后，再换成含有终浓度为2　　g/L的F-12培养液0.5 ml，培养42小时。移出上清液，改换含有185　　kBq的3H-Tdr的PRMI-1640培养液0.25ml，培养5小时。移出1640培养液，用冷PBS(pH 7.4)洗两次，10%三氯醋酸洗两次。加2% SDS液0.5ml将细胞移入液闪瓶，进行每孔的cpm计数。

　　5.细胞总RNA的提取：待FRTL-5细胞生长到1.5×106/瓶时，改换无bTSH的F-12培养液(即2H培养液)5　　ml继续培养4天。将每瓶培养液各吸出3ml(余弃之)分别加入刺激物后再加到原培养瓶中置37℃温育，其中：(1)作为阴性对照的正常人hIgG 5g/L刺激半小时；(2)作为阳性对照的bTSH，使其终浓度分别达到1、5、10U/L刺激半小时及10U/L刺激1小时；(3)TRAb分别为2或5　　g/L刺激半小时。然后倾去刺激液，采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取各瓶细胞总RNA，每瓶大约可获得30μg RNA。

　　6.1.3kb v-fos探针的制备和标记：用LB培养基培养带有pBR322质粒的E.coli菌。pBR322质粒经PvuⅡ和Bgl Ⅱ酶切后，行1%琼脂糖电泳，经低融点琼脂糖凝胶(Sigma)回收1.3kb片段。使用GIBCO公司的切口平移试剂盒(Nick Translation System)，按其说明书操作，将1μg v-fos DNA探针用1850kBq〔α-32P〕dCTP标记后，乙醇沉淀，溶于0.1ml TE溶液中。

　　7.Northern杂交和放射自显影：每份总RNA样品各取20μg，行甲醛变性胶电泳(3-4V/cm)约2.5小时后EB染色，以检测RNA的质量。随后凝胶用经DEPC处理过的超纯水淋洗数次，以去除甲醛。然后经毛细作用将RNA转移至硝酸纤维素膜上，晾干后，80℃干燥2小时，在不含甲酰胺的预杂交液中68℃预杂交2小时，再转入杂交液中，加入1μg经100℃，5分钟变性的v-fos标记探针，68℃杂交24小时。硝酸纤维素膜经漂洗后，夹在保鲜膜中，放入带有增感屏的暗盒-70℃放射自显影成像。

　　二、结果

　　1.TRAb刺激细胞外cAMP的积累：TRAb刺激FRTL-5细胞后，在正常对照组，TSH阳性对照组及TRAb组中cAMP的数值分别为0.92±0.51，2.10±1.87及1.77±1.15，经T检验分析，TSH组和TRAb组中cAMP水平均明显高于正常对照组(P＜0.05)，表明TRAb的作用类似于TSH。

　　2.TRAb刺激FRTL-5细胞生长：TRAb刺激FRTL-

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