酶联免疫吸附试验测定 1

荣墨克，　何成彦，　刘也，　吕晓平
(白求恩医科大学第三临床学院检验科，长春　130021)
印璞　(吉林省检验中心)

摘要　为了建立α1-酸性糖蛋白测定方法。以α1-酸性糖蛋白纯品免疫家兔，得抗α1-酸性糖蛋白抗体，用双抗体夹心酶联免疫吸附技术测定血清及体液α1-酸性糖蛋白。方法线性为0.05～5 mg/L，批内变异系数平均为5.6%，批间变异系数平均为9%，平均回收率为103%。该方法操作简便，测定只需50分钟，可用于血清和体液α1-酸性糖蛋白的临床常规测定。
关键词　α1-酸性糖蛋白；　急性期反应蛋白；　酶联免疫吸附试验

　　α1-酸性糖蛋白(α1-acid glycoprotein,AGP)又称类粘蛋白(Orosomucoid)，为一种糖蛋白，在蛋白电泳上位于α1球蛋白位，属急性期反应蛋白。在各种组织损伤或炎症、肿瘤时升高［1］。AGP是一些药物的主要结合蛋白，影响药物的动力学性质，测定AGP对指导临床用药有重要意义［2］。AGP由肝脏合成，肝脏有实质性病变时AGP降低。急性胆囊炎、急性胆管炎、胰腺囊肿所引起的阻塞性黄疸时，AGP增高，可与肝细胞性黄疸鉴别［3］。酶联免疫吸附试验可测定血液及体液AGP浓度，但测定时间均较长［4，5］。为了缩短测定时间，并保持试验的敏感性、精确性和准确性，我们根据对试验中各反应步骤的动力学观察，选择最适试剂用量及亚适当反应时间。
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　抗血清制备　用AGP(Sigma)免疫白兔，得抗血清后用等量的0.01 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液稀释，以硫酸铵沉淀法纯化抗体［6］。－20℃保存。
1.1.2　酶标记抗体制备　以纯化的AGP抗体用改良过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶［7］。－20℃保存。
1.1.3　试剂配制　包被液：30 mg/L抗AGP抗体，用0.1 mol/L pH 9.6的磷酸盐缓冲液稀释。洗涤液：0.5 ml Tween 20，加0.1 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液1000 ml。底物溶液：3.3-二氨基联苯胺盐酸盐4 mg，溶于0.5 ml丙酮，加9.5 ml 0.1mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液和0.1 ml 3%过氧化氢，用时配制。稀释液：每升含0.5 ml Tween 20的0.01 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液。
1.1.4　样品　血清用稀释液1000倍稀释，体液适量稀释或不稀释。
1.2　方法　酶标反应板加包被液300 μl，用封胶纸盖好置37℃ 2 h，洗涤3次，干燥后-20℃保存。将备用的包被酶标板加样品100 μl，置37℃ 20分钟，洗涤。加新配制的底物，置37℃10分钟，加50 μl 2 mol/L H2SO4终止反应，492 nm读吸光度。以标准曲线求得浓度。
1.2.2　标准曲线制作　用稀释液将AGP配制成0.05～5.0 mg/L，以浓度为横座标，吸光度为纵座标，绘制标准曲线。
2　结果
2.1　抗血清鉴定　抗血清与AGP做免疫扩散测得抗血清效价为1∶32。
2.2　酶标抗体质量鉴定　以AGP对酶标抗体做对流免疫电泳，得酶标抗体效价1∶16。以分光光度计对结合物进行定量测定，结合物酶量为0.46 mg/ml，摩尔比值为1.74，酶标记率(A403／A480)为0.54［8］。符合酶标抗体最佳效果。
2.3　包被液最适浓度测定　以吸光度1.025的稀释度为包被液最适浓度，其浓度为30 mg/L。
2.4　最适反应时间测定　对试验中各反应步骤在不同浓度时不同反应时间的观察，其最适反应时间是：包被浓度为30 mg/L 37℃时包被时间为2小时，免疫反应分别为20分钟，显色时间为10分钟。
2.5　方法学简评　AGP浓度在0.05～5.0 mg/L呈直线关系。批内和批间变异系数分别平均为5.6%、9.0%。平均回收率为103%。
2.6　参考值范围　取60份体检健康人血清和尿液，年龄23～60岁，男40例，女20例，15份常规及生化反应正常的脑脊液，年龄17～45岁，男9例，女6例，其参考值见附表。

　　附表　　　AGP参考值范围(mg/L)
 

样品 n 参考值范围 x±s
血　清 60 414～1 918 1 030±311

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