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三核苷酸重复性疾病PCR扩增片段的分析 |
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丁秀原 陈虹
在遗传性疾病的研究中，其中有一类疾病为三核苷酸异常重复所致，如脆性X综合征、享廷顿病分别因(CGG)n及(CAG)n序列重复异常引起。此类基因组DNA用PCR技术对特定片段进行扩增时，因G+C含量太高，常出现非特异性产物的高背景或异常产物，甚至出现不扩增现象，得不到DNA特异扩增带。我们在脆性X综合征基因分析研究中，使用PCR扩增产物与相应寡核苷酸探针杂交，能准确的判断FMR-1基因第一外显子5’端三核苷酸(CGG)n拷贝数，现报道如下。
材料和方法
附图 脆性X家系图谱 ■fra(X)患者 ⊙fra(X)携带者
一、基因组DNA：受检者为来自家系A、B的6例脆性X患者，3例女性携带者(附图)。45例正常人(男23例、女22例)为对照组。按低渗溶血法从外周血提取DNA。根据El-Aleem［1］方法，在PCR反应前，将0.8～1.0μg基因组DNA用2mol/L NaOH和1mmol/L EDTA在总体积20μl中室温化学变性5分钟，随后用2mol/L NH3OAC中和，冷乙醇沉淀，用变性DNA进行PCR扩增。
二、PCR分析：参照文献［2，3］，引物序列如下：5’TCAGGCGCTCAGCTCCGTTT3’和5’CTCCATCTTCTCTTCAGCCCT3’，当CGG重复为16拷贝时，扩增片段为250bp。在PCR反应体积中，每种引物0.5μmol/L，dNTP200μmol/L(其中7-deaza-dGTP：dGTP的浓度为3：1)，DMSO 5%，加入Taq DNA聚合酶和矿物油后，于DNA热循环仪进行PCR，PCR循环条件为94℃ 1分种，55℃ 2分钟，72℃ 2分钟，循环40次后于72℃再延伸10分钟。
三、PCR技术扩增的基因组DNA标本，用以下两种方法分析，根据Hinf1消化的PBR 322 DNA序列片段，来测定扩增片段的大小，从而推算出CGG三核苷酸重复序列的拷贝数。
1.银染法：取10μl扩增产物进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳(1×TBE缓冲液、200V电压，电泳约2小时)，凝胶用银染法显带(包括固定、银染、显色、定影、照相)。
2.PCR扩增产物杂交：取扩增产物10μl于1.8%琼脂糖凝胶上电泳16小时(1×TBE缓冲液，2V/cm)，将DNA转移到硝酸纤维膜上，用(r-32p)ATP(北京亚辉生物医学工程公司产品)标记的寡核苷酸探针(CGG)5杂文(60℃过夜)，洗膜温度控制在60℃、3×SSC、2×Denharts、5%SDS、25mmol/L NaH2PO43分钟，洗2次，1×SSC、1% SDS 30分钟，洗一次，-20℃放射自显影24小时。
讨 论
对脆性X综合征的特定DNA片段，我们用PCR技术检测FMR-1基因内不稳定DNA序列所含的CGG重复数。在同一次PCR扩增的5份DNA标本用不同方法所显示的结果，每份DNA样品的PCR反应体积25μl，取10μl用银染法分析，可见二条以上扩增带或无扩增带，因正常男性仅有一条X染色体，不可能产生二条特导扩增带，故此结果不可靠。当取相同的10μlPCR扩增产物与寡核苷酸探针(CGG)5杂交时，所得到的杂交带则肯定是特异扩增带，男性见一条杂交带，女性见一条或二条杂交带，并以此推算出所含的CGG重复数。以上结果说明，在实验中尽管采取扩增前将模板DNA化学变性，PCR反应体系中加入一定量的7-deaza-dGTP等措施，由于该DNA扩增片段富含G+C，易产生非特异扩增带，采用银染法显带时，仍难以确定特异的扩增带。因此，对PCR扩增片段的分析，我们采用了PCR扩增产物杂交法。结果表明：45例正常人(共67条X染色体)，9例女性DNA扩增产物显示二条杂交带，说明二条X染色体的FMR-1基因所含CGG重复数不等。另外13例女性及23例男性DNA样品均显示一条杂交带，杂交片段约240～360bp，表明正常等位基因含有13～52 CGG重复，其中约86%集中在32～39。6例脆性X患者因CGG重复大于200拷贝数(另文报道)，FMR-1基因已发生完全突变，在完全突变情况下产生不同长度的片段，这些不同长度片段是由于突变后在体细胞中不稳定造成，这些不同片段的同时存在使高度敏感的PCR扩增带为弥散区带(Smear)。3例女性携带者[1] [2] 下一页
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