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Wilson病ATP7B基因Arg778Leu突变与临床表型之相关性探讨 |
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D患者ATP7B基因特征，探讨ATP7B基因型和临床表型间的关系，我们将本院神经科门诊随访患者的ATP7B基因外显子8 Arg778Leu DNA检测结果报道如下。
材料和方法
一、病例来源
54例WD患者分别来自新华医院神经专科随访的51个家庭。发病年龄最小4岁7个月，最大39岁。其中3例<6岁，2例>35岁，余49例为6～17岁。男性33例，女性21例。31例表现肝脏损害，7例表现神经系统锥体外系症状，15例同时伴有肝和神经系统症状，1例无症状(其姐为先证者)。WD诊断根据患者的临床表现、血清铜氧化酶活性、血清铜蓝蛋白及血清铜、尿铜测定、KF环检查及影像学(如MRI)检查，并参照《实用儿科学》(诸福棠主编)、《神经病学》(史玉良主编)关于WD诊断标准综合判断与分型。
二、实验方法
1.DNA提取: 取外周静脉血3 ml, 2％EDTA 100 μl抗凝，常规分离白细胞，通过盐析法抽提基因组DNA。
2.PCR引物和反应条件: 根据文献［1］合成ATP7B基因第8外显子的相应PCR扩增引物：
ATP7B8a: 5′-aacccttcactgtccttgtc-3′
ATP7B8b: 5′-aggcagctcttttctgaac-3′
PCR反应体积为50 μl，其中包括dNTP各200 μmol/L, 引物各0.5 μmol/L, Taq DNA聚合酶(Promaga公司)2 U, 反应在PE2400热循环仪中进行，扩增条件分别为94℃ 30秒，52℃ 40秒和72℃ 40秒，35个热循环后，72℃延伸10分钟。经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增长度。
3.Msp I限制性内切酶消化：取PCR产物（外显子8）4 μl，Msp I 0.5 μl (5U)，MSP I缓冲液0.5 μl, 37℃消化过夜，于8%聚丙酰胺凝胶电泳分析，电泳时间3小时，电压100 V。
4.DNA序列分析：采用Sanger双脱氧链末端终止测序法，PCR引物一端在5′端标有生物素，PCR产物与链霉抗生物素蛋白包被的磁珠混合、纯化，应用T7酶系统测序药盒(Sequenase, 2.0 USB)进行DNA测序反应。经6％变性聚丙酰胺凝胶电泳测序，最后放射自显影48～96小时。
结 果
一、Msp I 限制性内切酶识别结果
ATP7B基因外显子8引物扩增的PCR片段长度为296 bp，正常序列经Msp I酶消化后成为256 bp和40 bp 2条片段；Arg778Leu基因突变纯合型片段296 bp；同时显示296 bp和256 bp（40 bp因片段过小显示不清）2片段为Arg778Leu基因突变杂合型(图1)。
M：DNA Marker DL200;1：未经Msp I消化的正常对照PCR产物；5：经Msp I消化的正常对照PCR产物；其他编号为WD患者PCR产物。2、7、8：显示未被Msp I识别，为778编码区异常纯合型；3、4：Msp I仅识别1个等位基因，为778编码区异常杂合型；5、6：被Msp I识别，为正常等位基因
图1 Msp I限制性内切酶消化ATP7B外显子8的778编码区部分结果
二、ATP7B外显子8 DNA序列分析
对所有患者DNA序列分析，在ATP7B基因外显子8区域发现2种基因突变，ATP7B基因778位密码子的第2个碱基发生错义突变(CGG→CTG)，即Arg778Leu。770位密码子的第3个碱基发生保守突变(CTC→CTG)，即Leu770Leu(图2)。
WD011、WD013：Arg778Leu基因突变(G-T)杂合型, 同时伴C2310G多态性；WD012：Arg778Leu基因突变纯合型, 同时伴C2310G多态性；正常对照：为正常序列
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