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分泌期及孕早期子宫内膜巨噬细胞及自然杀伤细胞的测定 |
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、研究尚未见有报道。本实验采用流式细胞技术，对子宫内膜及孕早期蜕膜中的巨噬细胞及NK细胞进行检测，了解子宫内膜局部免疫微环境对人类生殖的影响。
资料与方法
一、研究对象
1.蜕膜组: 19例，为1997年12月至1998年4月，在我院计划生育门诊要求人工流产、孕6～9周的正常妊娠妇女。既往月经规则,无病理妊娠史，本次妊娠期间无阴道异常出血,B超检查提示胚胎发育正常,有胚囊、胚芽及心管搏动。
2.内膜组： 11例,为1997年12月至1998年4月间，就诊于我院门诊正常未孕妇女，其中1例为要求放置宫内节育器的育龄期妇女，10例为男方精液异常的不孕患者，月经史、生殖系统解剖、内分泌及免疫功能等指标均正常。近3个月内无激素类药物使用史,妇科及盆腔检查均正常。
二、方法
1.标本来源：蜕膜组妇女行常规人工流产手术,吸出蜕膜及绒毛组织,识别出绒毛后,取蜕膜组织。内膜组妇女，均于月经第20～29 d取内膜，用特制的内膜活检刮匙取前壁、后壁内膜3～4块。
2.蜕膜和内膜单个核细胞分离:新鲜子宫内膜及蜕膜组织用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗2～3次，除去血凝块,小心去除蜕膜组织中绒毛组织。将洗净的内膜及蜕膜组织放置于金属小筛网中，用眼科小剪刀剪切成1 mm左右的组织块,4℃ PBS淋洗,用一次性注射器橡皮头研磨、挤压，4层纱布过滤,离心浓缩后溶于RIPM1640培养液中，以1∶2体积比平铺于Ficoll淋巴细胞分离液上，蜕膜组织分离以2000 r/min离心20 min；内膜组织分离为1000 r/min离心10 min。取出中间层淋巴细胞于RIPM1640培养液中洗涤2次,蜕膜组织稀释成1～5×106/ml的细胞悬液,内膜组织稀释为1～5×105/ml的细胞悬液。由于所取组织，尤其是内膜组织及部分蜕膜组织较少，故分离获得的单细胞悬液仅能达到一次流式细胞检测的含量，故蜕膜组的19例中仅11例同时进行巨噬细胞及NK细胞检测，2例仅检测NK细胞，6例仅检测巨噬细胞。内膜组中仅1例同时进行巨噬细胞及NK细胞的检测，其余10例随机分别进行巨噬细胞及NK细胞的检测。
3.巨噬细胞的荧光染色及流式细胞仪检测：取100 μl细胞悬液，加入10～20 μl异硫氰酸荧光素-白细胞分化抗原分化簇(CD)14单克隆荧光抗体标记(剂量为20 μl抗体/5×105个细胞)，4℃孵育40 min。PBS(含0.5％小牛血清)洗涤2次,用200 μl 1%的甲醛固定,300码滤网过滤后，用流式细胞仪检测。
4.NK细胞的荧光染色及流式细胞仪检测：取100 μl细胞悬液，加入10～20 μl异硫氰酸荧光素-CD16单克隆荧光抗体及藻红蛋白-CD56单克隆荧光抗体，进行双标记(剂量均为20 μl抗体/5×105个细胞)，4℃孵育40 min。PBS(含0.5％小牛血清)洗涤2次,用200 μl 1%的甲醛固定,300码滤网过滤后,用流式细胞仪检测。
5.主要检测指标:内膜与蜕膜组织中巨噬细胞即CD14阳性(CD+14)细胞百分比(%)，CD+56CD-16细胞亚群百分比(%)和CD+56CD+16细胞亚群百分比(%)。NK细胞(CD+56细胞)百分比(%)=CD+56CD-16细胞亚群百分比(%) + CD+56CD+16细胞亚群百分比(%)；CD+56细胞亚群比值=CD+56CD+16细胞百分比(%)/CD+56CD-16细胞百分比(%)。
三、统计学方法
结果以±s表示，对数据进行Student t检验。
结果
1.子宫内膜及蜕膜组织中巨噬细胞的含量：早孕蜕膜组织中巨噬细胞含量为（21.1±6.8）%，与分泌期子宫内膜含量［(7.8±6.9) %］相比，明显增加，差异有极显著性(P<0.01)。
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