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bcl |
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undation and experimental evidence for further study in vivo.
Key words：Cervix neoplsms; Oligonucleotides, antisense; Proto-oncogene proteins； Transfection; Genes, bcl-2▲
宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤，发病机理涉及原癌基因活化及抑癌基因失活导致的细胞凋亡与细胞增殖过程失衡。在此基础上，从基因水平寻求新的有效治疗方法，成为目前宫颈癌研究的热点之一。近年来，用反义脱氧寡核苷酸（oligodeoxynucleotide，ODN）及反义RNA分子作为基因治疗试剂，已成为临床应用研究的主要发展方向。鉴于bcl-2基因与宫颈癌发生、发展关系密切，本研究应用反义技术，进行bcl-2反义ODN/RNA对Hela细胞系的体外抑制实验，以探讨bcl-2作为基因治疗宫颈癌的优选靶向基因的可行性。
材料与方法
一、材料及来源
主要材料为人宫颈癌Hela细胞系（天津医科大学微生物教研室提供）；PA317包装细胞系及逆转录病毒载体 pDOR-neo （中国医学科学院血液病学研究所病理室及生化室提供）；转染剂脂质体Lipofe- ctamine及限制性内切酶BamHI、EcoRI（美国GIBCO公司提供）。bcl-2脱氧寡核苷酸（上海生物工程有限公司提供），共3条链，即反义链（antisense ODN, AODN）、正义链（sense ODN, SODN）、无义链（nonsense ODN, NODN），序列设计参考文献［1］。每条链两端由硫代磷酸修饰，经微机检索证明，与bcl-2以外的人类基因序列无同源性。含反义bcl-2 cDNA部分序列(622bp)的质粒重组逆转录病毒载体(pDOR-AB 7.12kb)，由第四军医大学王成济教授惠赠。
二、细胞培养
Hela细胞系及PA317包装细胞系常规培养于10%胎牛血清的RPMI-1640培养基（谷氨酰胺2 mmol/L，青、链霉素各100 μg/ml）中，置于37℃、5%二氧化碳饱和湿度培养箱内隔日传代。用AODN、SODN、NODN分别转染Hela细胞系，浓度为3 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L，转染后终止时间分别为12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h。
三、质粒DNA制备、基因转染、细胞包装及阳性克隆筛选
1．质粒DNA制备：宿主菌JM109感受态细胞的制备及转化、质粒的小量提取和大量制备、质粒DNA纯化、限制性内酶酶切及鉴定，参照《分子克隆指南》(第2版)［2］。
2．基因转染、细胞包装及阳性克隆筛选：取纯化质粒pDOR-AB与pDOR-neo（作为空白对照）各6.0μg，经脂质体Lipofectamine包裹后分别转染PA317包装细胞系，3 d后加入G 418（800 μg/ml）筛选，14 d后获抗G 418阳性克隆，取病毒上清液浓缩后脂质体包裹转染Hela细胞，命名为H-pAB、H-p，未转染的Hela细胞命名为H。
四、转染前后细胞动力学与细胞存活率检测
Hela细胞接种于96孔板，实验组共分24组，每个实验组及对照组各设12个重复孔。其中6孔用台盼蓝染色计数活细胞，每组重复测定3次，取平均值绘制细胞动力学曲线；另6孔应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定细胞存活率［波长570 nm时吸光度(A)值］。细胞存活率＝(实验孔A值/对照孔A值)×100%。
五、转染前后bcl-2蛋白及mRNA检测
采用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联（alkaline phosphatase antialkaline phospatase，APAAP）免疫酶标法及地高辛标记bcl-2脱氧寡核苷酸探针进行细胞原位mRNA杂交。检测结果评定标准为：细胞浆内有玫瑰红色颗粒为阳性细胞，未着色细胞为阴性细胞。原位杂交结果评定标准为，细胞浆内有蓝色颗粒为阳性细胞，未着色细胞为阴性细胞。
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