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大蒜素和更昔洛韦抑制巨细胞病毒所致细胞凋亡的实验研究 |
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方法，制成单层细胞，第10～20代用于本实验。
2.标准病毒株：CMV AD169病毒株，由中国预防医学科学院病毒研究所提供。
3.临床分离株：从CMV性肝炎患儿及无症状感染者尿中分离的CMV 7株(来自不同患婴)，传代次数少于10代，分别编号H1，H2，H3，H4，H5，H6，H7。
4.药物：大蒜素，由湖北医科大学药房生产，批号951044。更昔洛韦，由湖北省医药工业研究所提供。
5.探针来源：含bcl-2 cDNA及fas-cDNA片段的质粒由同济医科大学免疫教研室惠赠。bcl-2 cDNA片段长度为2.0 kb，于EcoR Ⅰ单酶切位点插入载体Bluescript质粒中，经氯化钙渗透法转化入JM101菌株；fas-cDNA片段长度为2.3 kb，于BamHI及XBal酶切位点插入载体pUC18，经氯化钙渗透法转化TG1菌株，再按常规方法提取质粒DNA，经酶切，回收，纯化后，获得bcl-2及fas cDNA探针。
6.试剂：抗巨细胞病毒即刻早期抗原(CMV-IEA)单抗由美国UAB儿童医院Britt教授提供(1∶100)；细胞凋亡原位检测试剂盒及地高辛标记检测试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司。
二、方法
1.细胞毒性实验：根据Mosmann建立的四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测药物细胞毒性［1］。具体方法是：用胰酶将HEL细胞分散成单个细胞悬液，按1×105/ml浓度分种于96孔板，24小时后换含不同浓度药物培养液，隔天换新鲜含药培养液，共3次。同时设不加药物的对照孔。12天后去掉培养液，加入含5 mg/ml MTT的无血清培养液，每孔100 μl，37℃，5%CO2箱内置4小时后，弃上清，加入二甲亚砜(DMSO)，每孔100 μl，混匀，5～10分钟后，置96孔酶标测定仪上，测570 nm波长下的吸光度A值(曾称光密度OD)。找出细胞对药物的最大耐受浓度(MTC)。
2.流式细胞仪检测细胞CMV-IEA：将HEL细胞按1×105/ml分种于内含飞片的24孔板，感染病毒2小时后，换含药培养液，同时设不加药物的病毒对照，24小时后，弃上清，用0.01 mol pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，0.25%胰酶消化3～5分钟后，弃消化液，加Hanks液，用吸管将细胞轻轻吹打下来，并移入离心管中，800～1 000 r/min，离心5分钟，弃上清，用PBS洗2次后，加入CMV-IEA单抗(1∶100)，37℃，30分钟，再用PBS洗2次后，加入荧光素标记的第二抗体(兔抗鼠IgG-FITC 1∶50)，37℃，孵育30分钟，PBS洗3次，置测定管，应用流式细胞仪(美国BD公司)测定荧光强度。
3.细胞培养及病毒感染：将HEL细胞按1×105/ml分种于内含飞片的24孔板，待细胞成片后，按100倍半数组织培养感染量(TCID50)/0.1 ml浓度接种CMV AD169病毒，37℃，5%CO2箱内吸附2小时，弃上清，用含2%小牛血清的培养液洗涤1次，再分别加入含MTC浓度不同药物的新鲜培养液，继续在上述条件下培养，隔天换液一次，同时设正常细胞对照组及病毒感染对照组。待病毒对照组细胞出现典型病变时，取出小飞片，PBS洗1次，风干，置4%多聚甲醛内，室温下固定30分钟后，常规乙醇逐级脱水，4℃保存；同时用0.25%胰酶将培养孔内细胞消化下来，制成单细胞悬液，800 r/min，离心5分钟，弃上清，细胞沉淀用PBS洗2次，用70%冷乙醇固定，4℃保存。
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