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大鼠胃窦部胃泌素和生长抑素mRNA及其相关蛋白表达的研究 |
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周 凡 葛振华 王若愚
(福建省中医药研究院病理研究所，福州 350003)
摘 要 为探讨大鼠胃窦部胃泌素mRNA和生长抑素mRNA在G、D细胞的转录及其相关蛋白的表达，用免疫细胞化学和原位杂交技术，检测了大鼠胃窦部G细胞内的胃泌素和D细胞内的生长抑素以及它们相应的mRNA。结果显示，大鼠胃窦部的G、D细胞位于幽门腺基部，细胞分布不均，单个或多个在一起；胃泌素和生长抑素均匀地分布于胞质内，核内阴性；G/D细胞比值在1.3±0.32～1.55±0.75之间，即G细胞多于D细胞。mRNA信号染色强度细胞间有差异，呈极性分布，多位于核周或核上胞质内。mRNA阳性细胞数在单位面积内少于G、D免疫组织化学显示阳性细胞数，原因可能是由于多聚甲醛的固定对mRNA的降解，降低了mRNA的活性，从而导致某些G、D细胞内mRNA不能被检出。该法具有安全、省时、定位准确等优点，适合一般实验室和临床诊断需要。
关键词 胃窦 G细胞 D细胞 胃泌素mRNA 生长抑素mRNA 原位杂交 大鼠
人与动物的胃窦部粘膜和腺上皮中，散在分布着较多的G、D细胞。G细胞分泌胃泌素，可刺激壁细胞分泌胃酸和胃粘膜的生长[1]；而D细胞则分泌生长抑素，以旁分泌方式调节G细胞胃泌素的分泌［2］；G、D细胞在调节胃酸的分泌方面起着重要作用。本研究用原位杂交和免疫细胞化学技术，初步探讨了在正常情况下，大鼠胃窦部胃泌素mRNA和生长抑素mRNA在G、D细胞的转录及其相关蛋白的表达。
材料和方法
1.标本制备
5只成年雄性Wistar大白鼠，体重180～200g，CO2窒息后，迅速取胃幽门部，用Lillie固定液固定，酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，(厚5μm)，用0.1%polylysine粘片，在60℃温箱烘烤2h，室温保存。
2.免疫细胞化学染色
切片脱蜡入水后，入0.2mol/L HCl 20min(阻断内源性碱性磷酸酶)，水洗5min,pH7.4的PBS(内含0.1% TritonX-100)20 min；加10%正常羊血清室温培育20min(减少背景非特异性染色)，除去多余液体后加兔抗人胃泌素抗体或兔抗人生长抑素抗体(-迈新公司试剂盒)，置湿盒内4℃冰箱过夜；次日取出湿盒，室温放置45min，PBS洗3次，每次5min；加生物素标记的羊抗兔IgG(1∶100)室温孵育90min；PBS洗3次，每次5min，加碱性磷酸酶标记的链亲合素(美国Zymed盒试剂)，室温20min；PBS洗1次5min，pH8.4 THB15min，用BCIP-NBT(Zymed盒试剂)暗处显色10 min，入5mmol/L EDTA终止反应，流水洗5min，甘油明胶封片。对照片用PBS代替第一抗体，其他步骤与实验片相同。
3.原位杂交
3.1 切片脱蜡入水后，用0.2mol/L HCl配制的0.03%胃蛋白酶室温消化20min，DEPC水洗5min，固定于4%多聚甲醛5min，DEPC水洗2次，每次2min。
3.2 入预杂交缓冲液60min，按我室过去的方法配制［3］；除去多余液体后加入杂交液，置潮湿容器内50℃温箱过夜。杂交液配制：预杂交缓冲液加入生物素标记的大鼠胃泌素或生长抑素探针,浓度为2μg/L(丹麦Larsson教授赠送),探针序列分别为Rat Gas5′-CTGGGGGTGGCTGGAGATG
-GCTGGGCT-3′与大鼠胃泌素mRNA互补，Rat Som 5′-TGAGTTAGCAGATCTCTGCAGCT-3′与大鼠生长抑素mRNA互补。次日，取出切片用37℃预热的0.1×SSC洗4次，每次15min。
3.3 检测杂交显色：pH7.4的TBS洗2次，每次5min，加鼠抗生物素的抗体(1∶100，DaKo)室温60 min；TBS洗3次，每次5min，加生物素标记的兔抗鼠IgG(1∶250,DaKo)室温45min；TBS洗后加碱性磷酸酶标记的链亲合素(1∶100，DaKo)室温30 min；pH8.4的预检测缓冲液15min，用BCIP-NBT显色15min，入5m mol/L EDTA 5min终止反应，流水洗5 min，甘油明胶封片。对照片不加探针，其他步骤与实验片相同。全部过程均须带手套，以免污染。
4.观察
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