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生后小鼠颌下腺神经生长因子基因表达的发育变化 |
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陆 璐 丁 斐* 曹 铮* 顾 静*
顾晓松* 汪家政** 范 明**
(南通医学院组织学胚胎学教研室，*分子生物学教研室，南通 226001；
**军事医学科学院基础医学研究所，北京)
摘 要 为了探讨在发育过程中小鼠颌下腺神经生长因子(NGF)基因表达的变化，应用原位杂交组织化学技术和图像分析方法对新生至2月龄ICR雄性小鼠颌下腺NGF mRNA的相对含量及分布进行研究。结果显示：新生小鼠颌下腺未见NGF mRNA杂交信号，8～10d龄小鼠颌下腺NGF原位杂交信号呈阴性至弱阳性。12～14d龄小鼠颌下腺NGF原位杂交信号呈弱阳性，分布于纹状管上皮细胞胞浆中。1月龄小鼠颌下腺纹状管和颗粒曲管NGF原位杂交信号均呈阳性，位于细胞核周围胞浆中。2月龄小鼠颌下腺纹状管和颗粒曲管NGF原位杂交信号呈强阳性，主要分布在上皮细胞核下部胞浆。实验结果提示，雄性小鼠颌下腺NGF基因在生后1～2周龄间开始转录，NGF mRNA含量在2月以前随年龄的增长而增多。
关键词 神经生长因子，颌下腺 发育 原位杂交 小鼠
神经生长因子(NGF)是调节神经系统重要的生物活性分子之一，大量的体外实验证实它是周围神经系统交感神经元、感觉神经元及中枢神经系统胆碱能神经元发育、分化、行使正常功能必不可少的营养分子［1］。近来研究表明，NGF还参与调节免疫、造血、内分泌和生殖等系统的功能［2］。NGF广泛存在于动物体内，以成年雄性小鼠颌下腺中含量最高。颌下腺合成与分泌的NGF一部分随唾液进入消化道，一部分直接进入血液发挥生物学作用。颌下腺NGF的含量受到多种激素和年龄变化的影响。甲状激素、雄性激素、肾上腺皮质激素等都对颌下腺NGF的合成具有调节作用［3,4］。尽管NGF已研究多年，但对NGF合成的基因调节及其调节的分子机理还不十分清楚，随着现代分子生物学技术的发展，使人们有可能从分子水平对NGF作进一步深入研究。新生小鼠颌下腺不存在NGF蛋白，在生长发育过程中NGF逐渐出现,并随着年龄的增长而增多[2]。本实验采用地高辛(digoxigenin,dig)标记的人(human,h) NGF\-βDNA探针，检测新生至2月龄ICR雄性小鼠颌下腺NGF mRNA的相对含量及分布，以探讨生长发育过程中颌下腺NGF基因表达的变化。
材料和方法
1.h NGFβDNA探针的制备
将hNGFβDNA基因片段克隆入PUC19质粒，转入JM103菌种(上述3种材料均由军事医学科学院基础医学研究所提供)，体外培养扩增，收集后用碱性法裂解细菌，酚-氯仿-异戊醇分步抽提法提取质粒DNA，纯化后经HindⅢ内切酶线性化作模板备用。按照Ullrich［5］报道的人NGF 基因DNA序列，分别合成两个19聚核苷酸引物，编码区为38-56的片段和346-364的片段，其核苷酸序列分别为：引物1，5′-GAATTCTCGGTGTGTGACA-3′；引物2，5′-CTATCTCACAGCCTTCCTG-3′。以人NGF基因片段为模板，使用地高辛标记探针试剂盒(Boehringer公司)，通过PCR扩增方法［6］制备dig-h NGF\-βDNA探针。
2.标本制备与处理
选用新生和生后8～10d、12～14d、1月、2月雄性ICR小鼠各8只(由本院实验动物中心提供)，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，生理盐水经左心室快速冲洗，4%多聚甲醛-0.1mol/L PBS灌注，取颌下腺后固定数小时，0.1mol/L PBS漂洗后入10%～30%苷糖-0.1mol/L PBS过夜，常规冰冻切片(厚(10～15 μm),裱贴于原位杂交专用载玻片上，4℃冰箱贮存备用。
3.原位杂交
参照陆璐［7］方法进行。主要步骤如下：0.3%Triton X-100 10min,蛋白酶K(1mg/L)37℃30min，43℃预杂交1h，43℃杂交12～16h。4×SSC 至0.1×SSC梯度漂洗各2×10min。抗地高辛抗血清-碱性磷酸酶(anti-Dig-AP)结合物(1∶500)4℃过夜，以硝基蓝四唑(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)显色(含左旋咪唑0.5g/L)。阴性对照以预杂交液代替杂交液和用无关DNA探针代替NGF DNA探针，其余步骤同实验组。
4.图像分析
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