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同时测定血清中苯巴比妥 苯妥英及卡马西平的反相高效液相色谱法 |
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romatography; drug monitoring
癫痫是神经系统一种常见病，绝大多数病人需长期规范地服药治疗。为了提高临床用药的有效性和安全性，减少或避免毒副反应，并为用药过量的中毒诊断和处理提供可靠的客观依据，很有必要进行此类药物在血液中浓度的监测。用高效液相色谱法(HPLC)同时测定数种抗癫痫药已有不少报道，但流动相多使用容易耗损仪器的磷酸盐缓冲液［1,2］或需加入昂贵的乙腈［3,4］，故该法在运用上存在一定的局限性。笔者就HPLC法同时测定血中苯巴比妥(PB)、苯妥英(PHT)及卡马西平(CBZ)浓度实验条件进行了探讨，现报道如下。
1 实验方法
1.1 仪器与试药 日本岛津LC-5A高效液相色谱系统，SPD-2AM紫外检测器，C-R2AX数据处理打印机，SIL-IA进样阀。
PB、PHT及CBZ对照品均由中国药品生物制品检定所提供。甲醇为优级纯试剂(北京化工厂)，二氯甲烷为分析纯试剂(上海化学试剂总厂)，磷酸二氢钠及磷酸氢二钠为分析纯试剂(上海试剂二厂)。
1.2 色谱条件 色谱柱：YGW-C18柱(250mm×4.6mm 10μm，大连化学物理研究所)，流动相：甲醇—水(60∶40)，流速1.0ml/min，柱温40℃，测定波长254nm，灵敏度0.01AUFS，纸速2cm/min，进样量20μl，柱压控制在100～110kg/cm2。
1.3 标准曲线的制作 用甲醇精密配制浓度均为1000μg/ml的PB、PHT、CBZ标准储备液，参考药物的有效血药浓度，用正常人血清准确配制以上3种药物2～80μg/ml的系列混合标准血清样品，共5管。其中1～5管中PB的浓度分别为5，10，20，40，80μg/ml，PHT的浓度分别为5，10，15，20，50μg/ml，GBE的浓度分别为2，4，8，16，32μg/ml，按下述方法进行处理：每个浓度做3管，每管测2次，根据同时测出3种药各种浓度之结果，以标准浓度为Y，不同浓度的峰面积之均值为X，作标准曲线及相关回归分析。
1.4 血清样品的处理 取血清100μl置具塞的5ml离心管内，加pH7.6的0.1mmol/L磷酸盐缓冲液100μl，再加1.5ml二氯甲烷，旋涡振荡3min(勿过于剧烈，以免混浊)，离心(3000rpm)10min，用细尖吸管吸弃上层水相，小心将底层二氯甲烷移至另一离心管中(注意切勿带入水相)，在高纯度氮气(99.99%)流下于50℃水浴中吹干二氯甲烷。沿管壁缓缓加入甲醇100μl，振荡溶解残留物。用微量进样器取上述甲醇溶液20μl由进样阀进样进行色谱分析。由样品的峰面积可分别在标准曲线上得出PB、PHT及CBZ的浓度值。
2 结果
2.1 色谱图形 空白血清及加样血清提取色谱图见图1和图2。
图1 空白血清色谱图 图2 标准血清色谱图
A(PB，tr4.198)，B(PHT，tr5.38)，C(CBZ，tr6.778) tr：保留时间。
2.2 线性关系 按本法将不同浓度的标准液作色谱分析，测得PB范围为5～80μg/ml，r=0.9992，a=-1.9737，b=0.0017；PHT范围为5～50μg/ml，r=0.9988，a=0.6134，b=0.0018；CBZ范围为2～32μg/ml，r=0.9996，a=0.4791，b=0.002。三个相关系数均有极显著意义(P<0.001)。说明三条标准曲线的线性关系极佳，具有良好的定量基础。
2.3 特异性和灵敏度 结果显示样品中PB、PHT、CBZ各峰分离度好，血清中的内源性物质对测定基本上无干扰。在上述条件下对10种抗精神病药物及其它常用药物进行分析，结果发现氯硝安定的保留时间与CBZ极为接近，峰形可相互重叠，但据服用常规剂量氯硝安定的患者的血浓度检测，结果无峰形出现，可见其浓度在检测限以下，故合并用常规剂量的氯硝安定一般不影响CBZ的测定。
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