夜香树提取物对小鼠白血病L1210细胞生长的抑制作用

　　1  材料和方法

　　1.1  药物 CN叶及嫩枝采自广西境内，经本院药用植物教研室刘寿养教授鉴定为茄科属植物夜香树Cestrum  nocturnum Linn.。

　　1.2  受试药物的提取及配制CN叶及嫩枝经日晒干燥后，采用渗漉法得乙醇浸膏，浸膏用硅胶拌匀后，依次用石油醚，醋酸乙酯，水饱和正丁醇，然后用95%乙醇和50%乙醇等回流提取，回收溶剂，得CN石油醚部位、 CN醋酸乙酯部位、CN正丁醇部位、CN多糖部位。CN正丁醇部位和CN多糖部位分别用生理盐水注射液配制成5 mg·ml-1，G6漏斗滤过除菌，4℃冰箱内保存备用。

　　1.3  细胞培养  L1210细胞系小鼠淋巴细胞白血病细胞，购自上海细胞生物研究所细胞库。将L1210细胞接种于DAB/2小鼠腹腔内，传代保种。临用时处死小鼠抽取腹水，离心收集细胞，经洗涤后用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液进行培养，在含5%CO2的37℃温箱中培养，每3 d传代1次。

　　1.4  MTT比色法［3］检测CN提取物对小鼠白血病L1210细胞增殖的影响取对数生长期的L1210细胞用含10% FBS的RPMI 1640培养液配成1×104·ml-1，接种在96孔培养板中，每孔200 μl，每组设4个平行孔。置37℃，10%CO2培养箱中培养24 h后, 离心弃上清，实验组分别加入最终浓度为62.5，31.25，15.62，7.81，3.90 μg·ml-1的CN提取物的培养液，正丁醇部位以及多糖部位的对照组则加入等体积溶剂的培养液，而石油醚部和醋酸乙酯部另设DMSO空白对照，加入等体积含DMSO的培养液；置37℃，10% CO2培养箱培养3 d后弃去上清液，加入200 μl /孔新鲜配制的含0. 2 mg·ml-1 MTT的无血清培养液，37℃继续培养4 h，弃去上清液，加入200μl /孔 DMSO，振荡混匀后，在酶标仪上以波长为550 nm，参比波长为450 nm测定OD值，测定时减去空白对照。实验重复4次。按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率。
   
　　肿瘤细胞生长抑制率%=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值) ×100%。

　　1.5  集落形成实验   取对数生长期的L1210细胞，用培养液配成每1 000/ml的细胞悬液，实验组分别加入不同浓度的CN提取物 (62.5，31.25，15.62，7.81 μg·ml-1和3.90 μg·ml-1)，对照组加入等体积的溶剂。取已融化的5%琼脂液1份，加入到9份37℃含10%胎牛血清的培养液中，加入到平皿，每个1ml,置室温凝固。取预温细胞按每9.4 ml加5%琼脂0.6 ml混匀，加到已铺底层琼脂平皿中，每个1 ml。置10 % CO2，37℃条件下培养7 d。在倒置显微镜下计数含50个细胞以上的集落数，计算集落形成抑制率：集落形成抑制率（%）=(1-给药组集落数/对照组集落数)×100%。

　　1.6  Hoechst 33258染色法 将L1210细胞接种于10%胎牛血清的培养基中，加96孔培养板中，每孔200 μl。实验组分别加入不同浓度的CN提取物，对照组加入等体积溶剂。置10%CO2，37 ℃培养72 h后，每孔取100 μl细胞悬液，加2 mmol·L-1Hoechst 33258 1 μl，37℃染色15 min，取40 μl滴到干净的玻片上，加盖玻片，在荧光显微镜下观察(40×)，随机计数300个细胞，计算细胞凋亡率。实验重复3次。

　　1.7  统计学处理 实验数据用±s，数据统计分析采用SPSS 10.0统计软件进行统计学处理，组间比较用t检验。

　　2  结果

　　2.1  CN提取

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