【摘要】 目的： 探讨Ki67蛋白在人皮肤血管瘤组织中的表达及在血管瘤发生、发展过程中的意义。方法 ：应用免疫组织化学方法检测了血管瘤增生期、退化期以及正常皮肤组织中Ki67蛋白的表达水平, 采用HPIAS1000图文报告管理系统对Ki67蛋白的表达进行定量分析，并用SPSS11.5软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q)检验。结果：Ki67蛋白在增生期血管瘤内皮细胞呈高表达,退化期呈低表达，增生期血管瘤内皮细胞与退化期比较, Ki67蛋白的表达差异有显著性(P<0.05);退化期血管瘤内皮细胞Ki67蛋白表达水平与正常组织相比，差异无显著性(P>0.01)。结论：Ki67可作为评价细胞增殖状态的一个指标。
【关键词】 皮肤血管瘤; Ki67蛋白; 免疫组织化学; 统计分析
血管瘤是婴幼儿中发病率最高的一种以内皮细胞异常增殖为组织学特征的肿瘤。新生儿患病率为1.1%～3.8%，至1岁时可高达10%。虽然部分血管瘤可以自行消退，但仍有部分未退化的血管瘤可持续发展或其生长部位特殊而具有一定的危险性，如果位于颜面、颅内及口腔可引起明显的畸形及功能障碍，如持续发展可产生溃疡、出血、感染等一系列并发症;位于颜面及口腔的血管瘤可引起明显的外观畸形及功能障碍，严重影响患者的身心健康[1～3]。临床治疗尤其对于大面积血管瘤的治疗尚缺乏确切、迅速有效的方法。目前为止，关于血管瘤发生、发展及退化的机制尚未完全明了, 因此给血管瘤的诊断和治疗带来许多困难。我们试图寻找引起皮肤血管瘤持续发展和增生的相关因子和因素，为治疗血管瘤提供理论依据。
目前研究表明，肿瘤的发生发展与细胞凋亡抑制和增殖能力的增强密切相关。Ki67是一种与增殖细胞相关的核抗原,是近年来研究最多、最具有前途的细胞增生标记。其功能被认为与细胞的有丝分裂密切相关。研究发现Ki67抗原是一种表达于细胞的增殖期核抗原,是一种核内蛋白质,与细胞增殖有关,静止期细胞表达很少,因此可作为评价细胞增殖状态的一个指标[4～6]。
本研究通过应用免疫组织化学方法和图像分析技术检测血管瘤增生期、退化期以及正常皮肤织中Ki67蛋白的表达水平，探讨Ki67蛋白在血管瘤增生过程中的作用机制，为临床上治疗血管瘤提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 材料来源 收集武汉大学人民医院病理科及武汉大学人民整形外科2000～2007年皮肤血管瘤存档蜡块50例，其中男性26例，女性24例。所有切片经病理学专家诊断为血管瘤。这些血管瘤所在的部位有头皮、前额、眼睑、耳背、颈部、背部、上臂、大腿、手和足的皮肤等。患者术前均未做任何辅助性治疗。
1.1.2 材料分组 常规HE染色，按Mulliken分类标准进行分组：增生期血管瘤27例，退化期血管瘤23例，另取瘤组织周围正常皮肤组织5例作对照。
1.2 主要试剂和仪器
1.2.1 主要试剂 ①即用型鼠抗人Ki67单克隆抗体(北京中山生物技术有限公司);②超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒(福州迈新公司);③DAB显色试盒及多聚赖氨酸(北京中山生物技术有限公司)。
1.2.2 主要仪器 ① YWY781型医用微波仪，250 W，50 Hz (浙江临安电子器材厂生产);② 家用高压锅;③ 电热恒温干燥箱 (湖北黄石医疗器械厂生产);④ 显微镜成像系统 (Olympus公司)。
1.3 方法
1.3.1 蜡块切片厚5 μm，贴片于涂有多聚赖氨酸的洁净载玻片上，置于烤箱烤干待用。常规HE染色。
1.3.2 免疫组织化学SP法检测Ki67抗原 具体步骤：① 4μm组织切片常规脱蜡至水后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;② 抗原修复(柠檬酸缓冲液微波抗原修复法)，室温自然冷却后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗5×3 min;③ 滴加3%过氧化氢，37℃湿盒孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;④ 正常羊血清37℃湿盒孵育10min以减少非特异性背景;⑤ 甩去多余血清，分别滴加一抗，4℃孵育过夜，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5 min;⑥ 滴加生物素标记的二抗37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;⑦ 滴加链霉素抗生物素蛋白过氧化物复合物37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS
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