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一氧化氮对肺泡巨噬细胞致炎效应的调节作用 |
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SA检测盒购自Biosource公司。NO产物检测盒购自军事医学科学院。
细胞收集纯化：小鼠麻醉后，分离气管，插入22G留置针，以5ml生理盐水灌洗全肺，重复10次。灌洗液离心，将沉淀细胞悬浮于RPMI1640培养基中，调细胞浓度为1×106／ml，加入24孔板，1ml/孔。37℃、5%CO2培养2小时，弃去未贴壁细胞，余为肺泡巨噬细胞。过氧化物酶染色鉴定巨噬细胞比例高于95%。
SMT抑制NO释放的量效时效关系：肺泡巨噬细胞受10mg.L－1 LPS刺激的同时，加入不同浓度的SMT(0、1、10、100、250、500、1 000μmol.L－1)，培养24小时收集上清，测定NO产物水平，同时用苔盼蓝染色观察细胞活力。
LPS刺激细胞因子释放的时效关系：肺泡巨噬细胞受10mg.L－1 LPS刺激0、2、4、6、8、12、24、36小时后收集上清，测定TNFα、IL-1β和IL-6浓度。
抑制内源性NO对LPS效应的影响：肺泡巨噬细胞受10mg.L－1 LPS刺激同时，加250μmol.L－1SMT。培养24小时，收集上清，测定TNFα、IL-1β和IL-6浓度。
外源性NO对SMT效应的逆转：肺泡巨噬细胞受10mg.L－1LPS及250μmol.L－1SMT刺激同时，加入不同浓度NO供体SNAP(0、10、50、100、500、1 000μmol.L－1)［3］，培养24小时，测定上清液中细胞因子及NO产物浓度。
外源性NO对细胞因子释放的影响：肺泡巨噬细胞受10mg.L－1LPS刺激的同时，加入50μmol.L－1SNAP，测定上清中TNFα、IL-1β和IL-10水平。
检测与统计学分析：TNFα、IL-1β、IL-6和IL-10采用ELISA法检测，NO产物浓度检测采用Geriss法，严格按试剂盒操作说明书进行。数据均以±s表示，组间比较采用配对t检验，P＜0.05为差异有显著性。
结果
LPS能导肺泡巨噬细胞释放NO。随着LPS刺激时间延长，NO释放增加(图1)。SMT明显抑制LPS诱导的NO释放，并具有剂量依赖关系。上清液中NO产物水平，随SMT浓度增加而降低(表1)。培养24小时后，具有活性的巨噬细胞高于90%。
图1 LPS刺激肺泡巨噬细胞释放NO的时效关系(鼠数＝4)
表1 SMT对LPS诱导的NO释放的影响(鼠数＝7)
SMT(μmol.L－1) NO
0
1
10
100
250
500
1000 61±16
57±15
47±14*
36±10*
17±5*
12±5*
9±5*
与SMT 0μmol.L－1比较，*P＜0.05
受LPS刺激后，肺泡巨噬细胞释放TNFα、IL-1β、IL-6的峰值分别在LPS刺激6、12和24小时(图2)。SMT抑制内源性NO释放使肺泡巨噬细胞释放IL-1β、IL-6明显增多，但对TNFα释放无明显影响(表2)。
图2 肺泡巨噬细胞受LPS刺激后释放炎症性细胞因子的时效关系(鼠数＝4)
LPS及SMT刺激肺泡巨噬细胞的同时，加入不同浓度SNAP，外源性补充NO，结果随SNAP浓度增加，NO释放明显增加，IL-1β、IL-6逐渐下降，而对TNFα释放无明显影响(图3)。而LPS刺激肺泡巨噬细胞的同时单纯给予SNAP，结果SNAP对TNFα释放无明显影响，IL-1β、IL-6和IL-10的释放显著减少(表2)。
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