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实验性大鼠胚胎脊髓移植对损伤脊髓影响的观察 |
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近几十年来，有关神经组织移植(neural tissue transplantation)的实验及临床工作已大量开展，并且在移植后的移植物的存活和对宿主的影响方面取得了巨大的进展。有关探索神经组织低温保存方法、复温后的存活率及低温保存对移植物存活和生长的影响的实验研究成为目前一个重要的研究方向。
材料与方法
一、实验动物
Wistar大鼠24只，体重230～260g，雌雄不限。对照组与移植组各12只,Wistar孕鼠2只。
二、致伤模型
两组动物乙醚吸入麻醉，俯卧位固定在手术台上，备皮、常规碘酒、酒精消毒，铺无菌巾，纵行切开背部皮肤及皮下组织，剥离棘突旁肌肉，切除T7棘突及椎板，暴露硬膜。将打击头(直径2mm)放置于硬膜上，将引导重物下落玻管调节至与重锤线平行后，连接打击头与打击器。将打击物(重10g)高度调节至5cm，使重物自然下落，打击量为50g·cm，迅速移开打击重物及打击头，逐层缝合伤口。术后每8小时挤尿1次。
三、胚胎脊髓组织的取材与保存
正常妊娠14天的Wistar大鼠经乙醚麻醉，在无菌条件下剖腹取胎。用显微手术器械分离胚胎脊髓组织，用DMEM（dulbecoo minium essential medium)培养液冲洗，除去血迹，并剪成约1mm×1mm×1mm大小的组织块。将其放入含20％同种鼠灭活血清、10％二甲基亚砜（dimethy sulfoxide,DMSO)的DMEM细胞培养液中，封口后放入4℃冰箱平衡1小时，依顺序置－20℃冰箱30分钟，－30℃冰箱10分钟及－70℃冰箱1小时，最后放入液氮中保存。
四、移植方法
(一)胚胎脊髓组织的复温与细胞悬液制备:胚胎脊髓组织保存10～15天后取出，于37℃恒温水浴槽中快速复温，完全融化后放入离心管，以3000转/分离心3分钟，弃去上清液，再加入等量DMEM培养液，混匀，静置3分钟，反复冲洗3次，使DMSO及血清成分尽量洗净。吸管反复吹打，过200目细胞滤网，制成约0.5ml细胞悬液备用。
(二)胚胎脊髓细胞悬液移植:将打击后的大鼠喂养4周后，进行乙醚麻醉，固定在手术台上，消毒，切开皮肤及皮下组织，按原入路暴露T7脊髓，垂直刺入损伤中心旁，刺入深度1～2mm，针与脊髓呈60°角，针尖指向头侧，匀速注入胚胎脊髓细胞悬液（fetal spinal cord suspensions)10ml。拔针时沿原针道，观察如无渗漏，逐层缝合伤口。移植过程于超净台内完成。术后继续喂养，每日挤尿3次。
五、观察方法
(一)标本取材：移植组动物于移植后喂养4周，对照组动物脊髓打击后喂养8周。将欲取标本的大鼠经乙醚吸入麻醉，打开胸腔，暴露心脏，主动脉插管，切开右心房，由主动脉缓慢注入生理盐水，待右心房溢出液体无色透明后，改用10％中性缓冲福尔马林溶液灌注，当右心房溢出刺激性气味液体，2分钟后停止灌注。从原入路暴露T7水平脊髓，并切除T4～10段脊柱，取出脊髓，标记损伤中心，放入10％福尔马林溶液固定。
(二)光镜检查石蜡包埋：移植或损伤段脊髓右侧在下，包埋；平行脊髓纵轴由向左连续切片，厚度为5～8μm，HE染色，嗜银染色，甲苯胺蓝染色。
(三)免疫组织化学检查：神经元微丝(neurofilament,NF)ABC法、5－羟色胺(5－HT)PAP法。
结果
一、病理学观察
对照组12只动物死亡2只，存活率83.3％；移植组12只动物死亡3只，存活率75％，存活动物脊髓内移植物均存活。
(一)对照组病理学观察结果：损伤后8周的大鼠脊髓损伤段明显变细，呈暗红色，与正常段脊髓明显不同，脊膜完整，与周围组织有粘连，固定后标本切面可见损伤段变窄，有的中间有裂缝。镜下可见损伤段脊髓中有一个长圆形或不规则的空腔，损伤腔边缘有胶质纤维瘢痕形成，损伤腔内未见神经细胞及纤维（图1）。银染显示宿主神经纤维在损伤腔边缘生长受阻、扭曲、未进入损伤腔（图2）。
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