行之有效的DNA体外扩增方法，在许多普通PCR无产物的基因扩增，都采用TDPCR，因此我们在VHL基因突变筛查中使用了普通PCR和TDPCR两种方法，并同时使用了TaKaRa Taq Hs进行了实验，期望能够得到良好的实验结果及建立TDPCR方法。
1 材料与方法
1.1 PCR扩增引物及模板 引物设计参考文献[1]，由大连宝生物工程有限公司合成。两组实验均以1例健康人类外周血基因组DNA为模板，外周血DNA提取采用大连宝生物工程有限公司D9081血液基因组提取试剂盒,严格按照说明书提取基因组DNA。
1.2 PCR扩增条件 50 μl 反应体系中包括：大连宝生物工程有限公司DR028A PCR混合浓缩试剂(Premix Taq Hot Start Version)25 μl，100 μmol/L 上下游引物各0.2 μl，基因组DNA100～200 ng，灭菌超纯水20.6 μl。
1.3 PCR扩增试剂及仪器 本次实验中使用的DR028A PCR混合浓缩试剂中含有的TaKaRa Taq Hs是抗Taq抗体和TaKaRa Taq的混合物，高温变性前抗Taq抗体与Taq酶结合，抑制聚合酶活性，能在低温条件下抑制引物的非特异性退火及引物二聚体的非特异性扩增，抗Taq抗体在PCR反应最初的DNA变性步骤中变性，无需特殊失活处理，在常规PCR条件下即可使用，同时PCR扩增产物3’末端含有一个“A”碱基，可直接连接T载体克隆。PCR所用仪器为美国ABI公司GeneAmp PCR System 9700型。
1.4 设计降落PCR程序 参考文献[2]所建议的TDPCR引物设计原则[从高于融解温度(Tm)值10 ℃，每次降低1 ℃(最终降至Tm值)]并做适当修改，对3对引物的Tm值进行预测，并根据全部退火温度值设定PCR循环程序中的温度变化范围，为照顾到3个片段，退火温度在最高65 ℃ 最低55 ℃ 的范围内，比较温度梯度以每降低1 ℃ 循环2次、最后在60～72 ℃ 再循环15次等一系列程序的扩增效果。
1.5 PCR 程序
1.5.1 普通PCR程序 循环参数为95 ℃ 预变性5 min，95 ℃ 变性45 s，第1、2和第3外显子的退火温度分别为63 ℃、59 ℃、57 ℃，退火45 s，72 ℃ 延伸45 s，30个循环后，72 ℃ 延伸10 min。
1.5.2 TDPCR程序 94 ℃ 预变性3 min;94 ℃ 46 s;65 ℃ 30 s，每次下降1 ℃ 直到55 ℃，每个温度上进行2轮循环反应;60 ℃45 s，72 ℃ 45 s，再循环15次;72 ℃ 延伸10 min;PCR产物在4 ℃ 下保存。
1.6 电泳 所有PCR产物均在2.0%(质量分数)琼脂糖凝胶中电泳，固定电压100 V。
1.7 纯化及测序 使用上海生工技术有限公司DNA胶回收试剂盒SK1132纯化PCR产物后，送该公司测序，所用测序仪器为ABI PRISM 3730，测序试剂为BigDye terminator v3.1。
2 结果
本次实验中用于扩增VHL基因的3个外显子和测序的引物见表1。TDPCR产物电泳结果未见非特异性二聚体，目的条带清晰明亮，见图1。普通PCR产物电泳结果可见大小约100 bp 左右的非特异性二聚体，同时加样孔下方带有部分片状拖带产物，目的条带较明亮清晰，见图2。TDPCR产物纯化后测序结果准确可靠，基本未见干扰波，见图3。普通PCR产物纯化后测序结果较准确可靠，在碱基G与A可见一蓝色干扰波，见图4。
表1 用于扩增VHL基因的3个外显子和测序的引物(略)
F：正向;R：反向
图1 TDPCR产物电泳结果(略)
图2 普通PCR产物电泳结果(略)
图3 TDPCR产物纯化后测序结果(略)
图4 普通PCR产物纯化后测序结果(略)
3 讨论
1991年Don等报道的TDPCR代表一种优化方法，其与普通PCR操作基本一致，只是编设一系列退火温度从较高温度开始逐步降低的循环反应程序，一组反应程序可同时扩增出不同特异性靶基因序列片段，并获得理想的扩增效果。该方法的基本原理是在设定程序时选择退火温度高于计算的Tm值10 ℃，随着循环的进行逐步降至Tm值，最终低至Tm值或低于Tm值5 ℃。这一方法可保障第一个引物与模板杂交发生在最互补的反应物(目的扩增片段)之间
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