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先天性红绿色觉异常基因缺失与杂种基因融合位点分析 |
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存在色觉基因的特殊变异［5］。为了进一步分析先天性红、绿色觉患者的基因缺失与融合位点，我们对不同患者及正常人的红与绿色觉基因的启动子及外显子2、3、4和5的来源与人组成进行了分析。
1 材料与方法
1.1 对象 先天性红色觉异常患者11例、绿色觉异常患者19例均来自中山眼科中心门诊，正常色觉者5名来自本院职工和本校学生，均为男性。
1.2 色觉功能测定 色觉功能经色盲本初筛后，再经色觉镜(Neitz)分类分型［4］。
1.3 基因组DNA制备 按常规方法抽提血白细胞基因组DNA。
1.4 色觉基因分析
1.4.1 PCR扩增和异源双链-SSCP分析 引物及扩增条件见表1，扩增外显子5同文献［4］，其它引物是根据基因序列自行设计的［1］。在PCR扩增前后，分别加上97℃模板变性7分钟和72℃延伸5分钟两个条件。所有PCR扩增均进行30个循环。然后作异源双链-SSCP分析。外显子3的电泳条件为10%(1∶49，0.25XTBE)胶室温电泳8小时、10%(1∶49，0.5XTBE)胶电泳9小时，其它产物的电泳条件为8%(1∶49，0.25XTBE)胶室温电泳8小时、8%(1∶49，0.5XTBE)胶电泳9小时(让其自然产热)和6%(1∶99，1XTBE)胶室温电泳6小时。
表1 PCR引物序列、扩增产物长度及扩增条件
Tab 1 Primer sequence， length of PCR products and conditions of amplification
Product
(产物) Locus*
(扩增位置) Sequence(5′-3′)
(序列5′-3′) Length(bp)
(扩增片段长度，bp) Annealing time
(复性温度)
promoter(启动子) 264-284 ccagcaaatccctctgagccg 229 60℃
472-492 ctatggaaagccctgtccccg
exon2(外显子2) 666-686 gtctggatgatctttgtggtc 198 60℃
844-863 gtggcccagcacgaagtagc
exon3(外显子3) 962-982 caagccctttggcaatgtgag 111 60℃
1052-1072 ctgctccaaccaaagatgggc
exon4(外显子4) 1073-1094 gtactggccccacggcctgaag 166 72℃
1218-1238 cgctcggatggccagccacac
exon5(外显子5) intron4-1247 tctcccttaggtggcaaag 260 58℃
1470-intron5 tgttgcttacctgccggtt
*根据Nathans等［1］的红与绿色觉基因的核酸序列编号；*The numbers come from paper［1］；intron 4(内含子4)；intron 5(内含子5)
1.4.2 银染分析 聚丙烯酰胺凝胶先在固定液(40%甲醇、10%乙醇和10%冰乙酸)中固定20分钟，然后在0.1%AgNO3液(含0.06%甲醛)中染色23分钟，速用三蒸水和显影液(含3%无水碳酸钠、0.06%甲醛和0.2mg/L硫代硫酸钠)漂洗胶块，在显影液显影至条带清晰，定影后干胶分析。
2 结果
2.1 红与绿色觉基因片段检测
在正常情况下，5对引物可以同时扩增分别来自红色觉基因与绿色觉基因片段。基于过去研究已确定的标准序列，可以通过异源双链-SSCP分析确定每对引物所扩增出的PCR产物来源。例如红色觉基因外显子4带型为r，绿色觉基因外显子4带型为g。正常色觉者有两种基因，其带型为rg(图1，样品41)；红色觉异常患者如缺失红色觉基因外显子4，其带型则为g(图1，样品44)；同理绿色盲患者则为r或rg(图1，样品42、43)。
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